Célula humana aislada, procedimiento para la obtención de la misma y su utilización.

Célula humana aislada, originada a partir de una línea celular humana de riñón transformada,

depositada con elnúmero de acceso FERM BP-10399 en el International Patent Organism Depositary, National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology

Célula humana aislada, procedimiento para la obtención de la misma y su utilización Sector técnico La presente invención se refiere a una célula humana aislada que es adecuada como célula huésped para producir un virus, tal como el Virus Hemaglutinante de Japón (en lo sucesivo referido como “HVJ”) o un producto génico exógeno, así como a un procedimiento para obtener la célula y la utilización de la célula.

Técnica anterior

El HVJ es un tipo de virus de la neumonía de ratón y no es infeccioso para el ser humano. Presenta dos tipos de glicoproteínas (F y HN) en su membrana externa viral que se fusiona a las células, y las proteínas presentan la capacidad de fusionarse a dos tipos de células (fusión celular) . En los últimos años, se ha desarrollado y comercializado una técnica que utiliza la envoltura de HVJ como vector (vector de envoltura de HVJ) (documento de patente 1) . La envoltura del HVJ se utiliza como el vector de envoltura de HVJ después de eliminar el ARN genómico de HVJ. Se encapsula un gen exógeno deseado en la envoltura y el virus se infecta en las células cultivadas o un órgano para transfectar el gen deseado en las células. Dado que se ha eliminado el ARN genómico del virus, la envoltura del HVJ es muy segura. Dado que la envoltura presenta la capacidad de fusionarse a células, la eficacia de la transfección a la célula es elevada. Se pueden encapsular una gran cantidad de genes exógenos y el espectro de huéspedes del virus es amplio. Por lo tanto, es esperable que el vector se utilice cada vez más como herramienta para analizar la función de los genes y como vector para terapia génica.

La producción en masa del HVJ se lleva a cabo de manera convencional mediante la inoculación del HVJ en huevos de pollo y haciendo crecer el virus (véase, Virus Experimental Protocols (“Protocolos experimentales para virus”) , Medical View Co., Ltd., 1995, 68-78) . Sin embargo, con este procedimiento, existe la posibilidad de que una proteína muy inmunogénica, tal como la albúmina de clara de huevo o similar u otras impurezas originarias del huevo del pollo, pueda estar contaminada en el HVJ recuperado. Por lo tanto, la OMS recomienda no utilizar los huevos de pollo, pero sí utilizar células cultivadas humanas. Cuando los huevos de pollo se utilizan como huésped, la operación de inoculación del virus y la operación de recuperación del virus después del crecimiento del mismo son complicadas, de manera que el rendimiento es limitado. Para resolver estos problemas, se ha pensado hacer crecer el HVJ utilizando células cultivadas de mamífero en lugar de huevos de pollo. Dado que los mamíferos son los huéspedes propios de HVJ, éste puede crecer en varias células de mamífero. Sin embargo, no se conocen células cultivadas de mamífero que sean adecuadas para la producción en masa del HVJ.

Documento de patente 1: JP 2001-286282 A Documento que no es de patente 1: Virus Experimental Protocols (“Protocolos experimentales para virus”) , Medical View Co., Ltd., 1995, 68-78

Côté y otros (Biotechnology and Bioengeneering, Volumen 59, No. 5: 567-575) dan a conocer la producción sin suero de proteínas recombinantes y vectores adenovirales por células 293SF-3F6. Sin embargo, estas células necesitan cultivarse en medio sin suero complementado con BSA (albúmina de suero bovino) al 0, 1% (p/v) y lípidos definidos químicamente al 1% (p/v) a efectos de inducir la viabilidad celular.

Descripción de la invención Problemas que se propone resolver la presente invención Un objetivo de la presente invención es dar a conocer una nueva célula humana aislada adecuada para la producción en masa del HVJ, así como un procedimiento para obtener la célula y la utilización de la célula.

Medios para resolver los problemas Como condición para que la célula sea adecuada como célula huésped para la producción del HVJ, los presentes inventores establecieron la condición de que la célula pueda crecer en un medio sin suero. Si la célula puede crecer en una célula sin suero, se puede eliminar la posibilidad de que el HVJ recuperado se contamine con una sustancia originaria del suero, tal como albúmina de suero, lo cual es ventajoso. Los presentes inventores también pensaron que es ventajoso utilizar una célula que puede crecer en un biorreactor, que es ventajoso utilizar una célula que se puede cultivar en suspensión en un medio de cultivo líquido. Además, los presentes inventores pensaron que es ventajoso si se puede conseguir una densidad celular elevada en el medio líquido y que la célula presente una capacidad de crecimiento elevada. Los presentes inventores incluso pensaron adicionalmente que es ventajoso para la facilidad de manipulación, almacenamiento, transporte y similares, que la célula pueda crecer incluso una vez se ha congelado y, a continuación, descongelado. Los presentes inventores incluso pensaron adicionalmente que dado que la terapia génica y el análisis de la función de los genes se realizan principalmente en el ser humano, resulta ventajosa una célula humana. Los presentes inventores estudiaron de manera intensa para obtener una célula humana que satisfaga estas diversas condiciones. Como resultado, los presentes inventores consiguieron de manera satisfactoria obtener una célula humana que satisface las diversas condiciones descritas anteriormente mediante la selección y clonación de una célula en diversas condiciones que utilizan una línea celular humana de riñón transformada como célula parental, conformando, de este modo, la presente invención.

Es decir, la presente invención da a conocer una célula humana aislada originada a partir de una línea celular humana de riñón transformada, tal como se define en las reivindicaciones. Se da a conocer un procedimiento para obtener una célula humana, comprendiendo el procedimiento las etapas de cultivar en suspensión una línea celular humana de riñón transformada en un medio sin suero y clonar las células desarrolladas; y seleccionar, entre las células clonadas, una célula cuyo tiempo de duplicación en la fase logarítmica de crecimiento en el cultivo en suspensión en un medio sin suero no es superior a 40 horas, que presenta la propiedad de recuperación en estado de congelación, cuya densidad máxima de células viables en el cultivo en suspensión no es inferior a 106 células/ml, en la que el HVJ puede crecer. La presente invención incluso da a conocer adicionalmente un procedimiento de producción de un virus, comprendiendo el procedimiento inocular un virus deseado en la célula humana aislada, según la presente invención; hacer crecer el virus en la célula; y recuperar el virus desarrollado.

Efectos de la invención Mediante la presente invención, se dio a conocer por primera vez una célula humana aislada que es adecuada para la producción en masa del HVJ. Dado que la célula humana aislada, según la presente invención, puede crecer en un medio sin suero, no existe la posibilidad de que el virus recuperado esté contaminado con una sustancia originaria del suero, cuando un virus, tal como el HVJ, se hace crecer utilizando las células como huésped y se recupera el virus. Además, dado que la célula humana aislada, según la presente invención, puede crecer mediante el cultivo en suspensión en un medio líquido, dado que la velocidad de crecimiento es elevada y dado que la célula se puede cultivar a una densidad elevada, la célula es adecuada para la producción en masa de un virus utilizando un biorreactor. Adicionalmente, dado que la célula presenta la propiedad de recuperación en estado de congelación, es conveniente el almacenamiento y transporte de las células.

Breve descripción de los dibujos Figura 1 Aclimatación de las células en un medio sin suero: la figura 1 muestra los resultados cuando las células se cultivaron durante un periodo de tiempo largo utilizando T6 y HyQ que mostraron una capacidad de crecimiento elevada, procediendo, de este modo, a la aclimatación de las células en un medio sin suero. VC significa células viables, y el % significa la tasa de supervivencia.

Figura 2 Prueba de producción del HVJ de clones individuales durante la clonación: la figura 2 muestra los resultados de la medición de la producción de HVJ mediante la prueba de FFU llevada a cabo mediante el procedimiento en el que se tomó una alícuota de los clones individuales durante la clonación en una placa de 96 pocillos, se añadieron a la misma tripsina (concentración final: 2 μg/ml) y HVJ (multiplicidad de la infección; MOI = 23) , se cultivaron las células a 34°C en una incuba dora de CO2 al 5% durante 3 días, y se recuperó el sobrenadante. Las cifras por debajo del eje de abscisas indican la cantidad de clones.... [Seguir leyendo]

1. Célula humana aislada, originada a partir de una línea celular humana de riñón transformada, depositada con el

número de acceso FERM BP-10399 en el International Patent Organism Depositar y , National Institute of Advanced 5 Industrial Science and Technology.

2. Banco primario de células que comprende un conjunto de recipientes, comprendiendo cada uno dicha célula humana aislada, según la reivindicación 1.

3. Procedimiento de producción de un virus, comprendiendo dicho procedimiento inocular un virus deseado a dicha célula humana aislada, según la reivindicación 1; hacer crecer dicho virus en dicha célula; y recuperar el virus desarrollado.

4. Procedimiento, según la reivindicación 3, en el que dicho virus es el virus hemaglutinante de Japón o adenovirus. 15