Cápsides de AAV rh48 modificadas, composiciones que las contienen y usos de las mismas.

Un vector de virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside AAVrh48 (rh48.

2) modificada, comprendiendodicha cápside modificada la secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 44, la cual ha sido modificada para quecontenga una asparagina en la posición 304 de residuo de aminoácido, que de forma nativa es una serina.

Cápsides de AAV rh48 modificadas, composiciones que las contienen y usos de las mismas.

Antecedentes de la invención Un virus adeno-asociado (AAV) , un miembro de la familia Parvovirus, es un pequeño virus icosaédrico, sin envoltura, con genomas de ADN lineales de cadena simple de 4, 7 kilobases (kb) a 6 kb. El AAV está asignado al género, Dependovirus, debido a que el virus fue descubierto como contaminante en poblaciones de adenovirus purificadas. El ciclo vital del AAV incluye una fase latente en la que los genomas de AAV, tras la infección, están integrados específicamente en el sitio en cromosomas anfitrión y una fase infecciosa en la que, a continuación de una infección cualquiera por adenovirus o virus simplex del herpes, los genomas integrados son posteriormente rescatados, replicados y empaquetados en virus infecciosos. Las propiedades de no patogenicidad, amplia gama de infectividad de anfitrión, incluyendo células no divisoras, e integración cromosómica potencial específica del sitio, hacen que el AAV sea una herramienta atractiva para transferencia de gen.

Los vectores de AAV han sido descritos en cuanto a su uso como vehículos de suministro tanto para moléculas terapéuticas como inmunogénicas. Hasta la fecha, han existido varios AAVs diferentes bien caracterizados, aislados a partir de humanos o de primates no humanos (NHP) .

Recientemente, los investigadores han descrito una gran numero de AAVs de secuencias diferentes [G. Gao et al., Proc. Natil. Acad. Sci. USA, 100 (10) : 6081-6086 (13 de Mayo de 2003) ; US-2003-0138772-A1 (24 de Julio de 2003) ] y caracterizados estos AAVs en diferentes serotipos y clados [G. Gao, et al., J. Virol., 78 (12) : 6381-6388 (Junio 2004) ; Publicación de Patente Internacional núm. WO 2005/033321]. Se ha informado que diferentes AAVs presentan diferentes eficacias de transfección, y también muestran tropismo para diferentes células o tejidos.

Lo que resulta deseable son construcciones basadas en AAV para el suministro de moléculas heterólogas a diferentes tipos de células.

Sumario de la invención La presente invención proporciona, según un aspecto, un vector de virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside de AAVrh48 modificada (rh48.2) , comprendiendo dicha cápside modificada una secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 44, la cual ha sido modificada para que contenga una asparagina en la posición 304 de residuo de aminoácido, la cual es una serina en forma natural. En algunas realizaciones, la cápside está además modificada para que contenga un ácido glutámico en una posición 217 de residuo de aminoácido de SEQ” ID Núm. 44, la cual es de forma natural una lisina.

En realizaciones particulares de la invención, el vector viral porta un transgén que codifica un producto de gen bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen expresión del producto en una célula anfitrión.

La invención se extiende también a composiciones que comprenden vectores de AAV conforme a la invención, en combinación con portadores fisiológicamente compatibles.

Un uso particular de vectores y de composiciones de acuerdo con la invención consiste en suministrar un producto de gen a un sujeto.

Según otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cápside de AAVrh48 modificada, que posee una secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 44 que ha sido modificada para que contenga una asparagina en la posición 304 de residuo de aminoácido, la cual es de forma natural una serina. En algunas realizaciones, la cápside está además modificada para que contenga un ácido glutámico en la posición 217 de residuo de aminoácido de SEQ ID Núm. 44, la cual es de forma natural una lisina.

Otros aspectos y ventajas de la invención resultarán fácilmente evidentes a partir de la descripción detalladla que sigue de la invención.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 es un gráfico que ilustra transducción 293 in vitro de vectores de AAV corregidos en singletón. Las correcciones de singletón están indicadas a continuación del nombre del vector, cuando están presentes, con un número que indica el número de mutaciones realizadas;

Las Figuras 2A-2C son gráficos lineales que ilustran la titulación de vectores de AAV sobre células 293 en multiplicidades de infección comprendidas en la gama de 101 a 104, con una comparación entre rh.8 dominante y rh.8 corregido en singletón (rh.8R) en la Figura 2A, rh.37 dominante y rh.37 modificado (Figura 2B) , y AAV2 y AAV8 en la Figura 2C. Como control, una titulación similar de eGFP de AAV2 y de AAV2/8 que expresa que el vector está

presente. El porcentaje (%) de células positivas de eGFP se ha representado sobre el eje Y, y fue ensayado mediante citometría de flujo.

La Figura 3 es un árbol filogenético de secuencias de AAV, que indica su relación filogenética y clados.

Las Figuras 4A-4K son un alineamiento de secuencias de ácido nucleico de la proteína de cápside (vp1) de AAV2 [SEQ ID Núm. 7], cy. 5 [SEQ ID Núm. 8], rh.10 [SEQ ID Núm. 9], rh.13 [SEQ ID Núm. 10], AAV1 [SEQ ID Núm. 11], AAV3 [SEQ ID Núm. 12], AAV6 [SEQ ID Núm. 13], AAV7 [SEQ ID Núm. 14], AAV8 [SEQ ID Núm. 15], hu. 13 [SEQ ID Núm. 16], hu. 26 [SEQ ID Núm. 17], hu. 37 [SEQ ID Núm. 18], hu. 53 [SEQ ID Núm. 19], rh.39 [SEQ ID Núm. 20], rh.43 [SEQ ID Núm. 21] y rh.46 [SEQ ID Núm. 22];

Las Figuras 5A-5D son un alineamiento de las secuencias de aminoácido de la proteína de cápside (vp1) de AAV2 [SEQ ID Núm. 23], cy.5 [SEQ ID Núm. 24], rh.10 [SEQ ID Núm. 25], rh.13 [SEQ ID Núm. 26], AAV1 [SEQ ID Núm. 27], AAV3 [SEQ ID Núm. 28], AAV6 [SEQ ID Núm. 29], AAV7 [SEQ ID Núm. 30], AAV8 [SEQ ID Núm. 31], hu.13 [SEQ ID Núm. 32], hu.26 [SEQ ID Núm. 33], hu.37 [SEQ ID Núm. 34], hu.53 [SEQ ID Núm. 35], rh.39 [SEQ ID Núm. 36], rh.43 [SEQ ID Núm. 37] y rh.46 [SEQ ID Núm. 38];

Las Figuras 6A-6B son un alineamiento de las secuencias de aminoácido de la proteína de cápside (vp1) de rh.13 [SEQ ID Núm. 26], rh.2 [SEQ ID Núm. 39], rh.8 [SEQ ID Núm. 41], hu.29 [SEQ ID Núm. 42], y rh.64 [SEQ ID Núm. 43].

Descripción detallada de la invención La presente invención ha sido concebida usando el “método de singletón” de la solicitante, la cual tiene como objetivo mejorar el rendimiento de empaquetamiento, la eficacia de transducción y/o la eficiencia de transferencia de gen de un vector de AAV que tiene una cápside de un AAV que contiene uno o más singletones. Este método se describe con mayor detalle en lo que sigue y es también objeto de la solicitud de Patente Europea núm. 06749685.1 (de la cual deriva la presente solicitud por división) .

Según se utiliza a través de la presente memoria y de las reivindicaciones, los términos “comprendiendo” e “incluyendo” incluyen otros componentes, elementos, integrantes, etapas y similares. A la inversa, el término “consistiendo” y sus variantes son excluyentes de otros componentes, elementos, integrantes, etapas y similares.

Método de singletón Según se utiliza en la presente memoria, el término “singletón” se refiere a un aminoácido variable en una posición dada de una secuencia de cápside de AAV seleccionada (es decir, parental) . La presencia de un aminoácido variable se determina mediante alineamiento de la secuencia de la cápside de AAV parental con una librería de secuencias funcionales de cápside de AAV. Las secuencias son analizadas a continuación para determinar la presencia de cualesquiera secuencias variables de aminoácido en la cápside de AAV parental donde las secuencias del AAV en la librería de AAVs funcionales tienen una conservación completa. La secuencia de AAV parental es alterada a continuación para cambiar el singletón al aminoácido conservado identificado en esa posición en las secuencias de cápside de AAV funcionales. Una secuencia de AAV parental puede tener de 1 a 6, de 1 a 5, de 1 a 4, de 1 a 3, ó 2 singletones. Una secuencia de AAV parental puede tener más de 6 singletones.

Una vez modificada, la cápside de AAV modificada puede ser usada para construir un vector de AAV que tenga la cápside modificada. Este vector puede ser construido usando técnicas conocidas por los expertos en la materia.

El AAV seleccionado para su modificación de acuerdo con el método, es uno para el que resulta deseable incrementar una cualquiera o más de las tres propiedades funcionales siguientes de AAV, es decir, empaquetamiento en la partícula viral que tiene la cápside de la secuencia de AAV seleccionada, incremento de la eficacia de transducción, o incremento de eficacia de transferencia... [Seguir leyendo]

1. Un vector de virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside AAVrh48 (rh48.2) modificada, comprendiendo dicha cápside modificada la secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 44, la cual ha sido modificada para que contenga una asparagina en la posición 304 de residuo de aminoácido, que de forma nativa es una serina.

2. El vector de AAV conforme a la reivindicación 1, en el que la cápside AARrh48 está además modificada para que contenga un ácido glutámico en la posición 217 de residuo de aminoácido de SEQ ID Núm. 44, que de forma nativa es una lisina.

3. El vector de AAV conforme a la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho vector porta un transgén que codifica un producto de gen bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen expresión del producto en una célula anfitrión.

4. Una composición que comprende un vector de AAV conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y un portador fisiológicamente compatible.

5. Un vector de AAV conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una composición conforme a la reivindicación 4, para su uso en el suministro de un producto de gen a un sujeto.

6. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cápside AAVrh48 modificada, que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 44, la cual ha sido modificada para que contenga una asparagina en la posición 304 de residuo de aminoácido, que es de forma nativa una serina.

7. La molécula de ácido nucleico conforme a la reivindicación 6, en la que la cápside AAVrh48 está además modificada para que contenga un ácido glutámico en la posición 217 de residuo de aminoácido de SEQ ID Núm. 44, que es de forma nativa una lisina.