Biomarcadores para inhibidores con actividad anti-angiogénica.

Método ex vivo para la medición del efecto de un inhibidor de la integrina alfa (v) sobre la angiogénesis,

en dondeel inhibidor de la integrina es mAb DI-17E6 o el péptido RGD cilengitide, y/o la eficacia terapéutica de un inhibidor deese tipo contra una enfermedad asociada a la angiogénesis, mediante al menos un gen biomarcador específico o unproducto génico del mismo seleccionado del grupo que consiste en ADAMTS1, STC1, EDN1, MCP1, IL8, PDGF-BB,CRP, ligando CD40, e IL6, en donde, (i) debido a la administración del respectivo inhibidor de la integrina, ADAMTS1y STC1 son incrementados de manera regulada y MCP1, EDN1 y PDGF-BB son reducidos de manera regulada, (ii)debido a la administración del cilengitide IL-8 es reducida de manera regulada; y (iii) debido a la administración deDI-17E6, IL8, IL6 y CRP son incrementados de manera regulada, y el ligando CD40 es reducido de maneraregulada;

donde el método comprende las siguientes etapas:

(a) medir mediante medios y/o dispositivos técnicos la concentración de referencia y/o el estado demodificación de dicho biomarcador seleccionado en una muestra de un fluido corporal o tejido, mediante elcual se obtiene la muestra de un individuo que no ha sido tratado con dicho inhibidor;

(b) medir mediante medios y/o dispositivos técnicos la concentración y/o el estado de modificación dedichos biomarcadores seleccionados en una muestra de (a) obtenida de un individuo que ha sido tratadocon dicho inhibidor o en una muestra de (a) que es tratada en una etapa posterior con dicho inhibidor.

(c) medir mediante medios y/o dispositivos técnicos las diferencias entre las concentraciones y/o el estadode modificación de los biomarcadores seleccionados obtenidos mediante la etapa (a) y (b);

(d) determinar a partir de dichas diferencias obtenidas de la etapa (c) una o más de las siguientespropiedades o parámetros de los inhibidores:

-- efectos farmacodinámicos sobre la diana molecular y sobre las respectivas vías de señalizaciónligadas a la diana molecular,

-- el efecto sobre la angiogénesis,

-- la eficacia del tratamiento y el resultado clínico en un paciente con una enfermedad asociada a laangiogénesis, y de manera opcional

(e) repetir las etapas (a) a (d) hasta que se obtengan las propiedades / parámetros deseados,permitiendo, de ese modo, la evaluación de las medidas clínicas y actividades con respecto al efecto sobre laangiogénesis o la eficacia terapéutica, seguridad, pronóstico o dosificación de dicho inhibidor, o enfermedadesrelacionadas con la angiogénesis en un individuo.

Biomarcadores para inhibidores con actividad anti-angiogénica Área de la invención La presente invención hace referencia a un método para la evaluación del efecto de inhibidores de la integrina sobre la angiogénesis mediante el uso de determinados biomarcadores identificados. Este método es particularmente beneficioso para la determinación de la eficacia de los inhibidores de la integrina utilizados principalmente para el tratamiento de enfermedades asociadas a la angiogénesis tales como el cáncer. En especial, la presente invención hace referencia a biomarcadores ligados a la angiogénesis, a los que se accede preferiblemente en los fluidos corporales y por lo tanto permiten el análisis de la modulación diana de forma no invasiva. También se revela el uso de dichos biomarcadores para el cribado de compuestos con actividad inhibidora de la integrina, preferiblemente el anticuerpo DI-17E6 y el péptido cilengitide de RGD.

Antecedentes de la invención La angiogénesis se aplica generalmente a la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de la vasculatura preexistente. La proliferación de células endoteliales que experimentan la síntesis de ADN es una señal de brotes vasculares microvasculares, mientras que los brotes extensivos requieren principalmente la migración de células endoteliales. La angiogénesis es un proceso fundamental que es orquestado por una variedad de factores angiogénicos e inhibidores. Los activadores de la proliferación de células endoteliales y la migración son principalmente ligandos receptores tirosina quinasa, tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , factor de crecimiento de fibroblastos (FGFs) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y factor de crecimiento epidérmico (EGF) , pero puede también ser de un origen muy diferente, tal como un origen lisofosfático (LPA) (Bergers et al. (2003) Nature Reviews 3, p. 401- 410) . El EGF aumenta de manera regulada el VEGF, FGF la interleucina-8 (IL-8) , mientras que el LPA aumenta de manera regulada los niveles de VEGF. El primer inhibidor angiogénico descrito fue la trombospondina- 1, que modula la proliferación y movilidad celular. De manera extraordinaria, muchas moléculas inhibidoras, tales como las estatinas, se derivan de proteínas de mayor tamaño que no ejercen efecto alguno en la angiogénesis; por ejemplo, la angioestatina, un fragmento de plasminógeno que se une a la ATP sintasa y anexina III además de endostatina, tumstatina y canstatina (fragmentos de colágenos que se unen a integrinas) . En general, los niveles de activadores e inhibidores indican si una célula endotelial estará en un estado quiescente o angiogénico. Se cree que los cambios en el equilibrio angiogénico actúan como mediadores en la activación de la angiogénesis.

Su papel fisiológico se enmarca en el desarrollo, reproducción y reparación de células, tejidos y órganos. La angiogénesis patológica es necesaria para que los tumores y sus metástasis crezcan más allá de un tamaño microscópico, y puede dar lugar a sangrado, derrame vascular y destrucción de tejidos. Las consecuencias de la angiogénesis patológica pueden ser responsables, directa o indirectamente, de los síntomas, incapacitación o muerte asociada a un amplio rango de enfermedades asociadas a la angiogénesis. Ejemplos de tales enfermedades incluyen trastornos tumorales, enfermedades autoinmunes, degeneración macular y aterioesclerosis entre otras.

En referencia a la progresión tumoral, la activación de la angiogénesis puede ocurrir en diferentes etapas de la vía de progresión tumoral, dependiendo del tipo de tumor y el entorno. Sin embargo, la neovascularización es habitualmente un requisito previo de la progresión tumoral.

Varias vías de señalización están implicadas en el proceso de la angiogénesis. El VEGF juega un papel central en la vasculogénesis y la angiogénesis; de todos los factores angiogénicos, el VEGF es el factor más frecuentemente asociado con la progresión tumoral y la metástasis. La evidencia preliminar sugiere que la sobreexpresión de varias isoformas puede tener efectos diferenciales sobre los tumores.

Las etapas clave en la angiogénesis asociada a tumores incluye la secreción de VEGF por parte de células tumorales que se unen a su receptor VEGFR2 y a la neuropilina en las células endoteliales (Folkman 2007, Nature Reviews, 6, p. 273-286) . Es el más común de los al menos seis diferentes factores angiogénicos de los tumores. Las metaloproteasas de matriz (MMPs, por sus siglas en inglés) se liberan a de células tumorales, pero también mediante células estimuladas por VEGF. Las MMPs movilizan las proteínas pro-angiogénicas del estroma, pero también dividen el inhibidor angiogénico endostatina del colágeno 18 en la pared vesicular y participa en el corte del inhibidor angiogénico angiostatina del plasminógeno circulante. Las células tumorales secretan angiopoyetina 2 (ANGPT2) que compite con la ANGPT1 para unirse al receptor endotelial TIE2. La angiopoyetina 1 (ANGPT1) , expresada por muchas células, se une al receptor endotelial TIE2 (también conocido como TEK) , y ayuda a mantener un estado normalizado en el vaso sanguíneo. La ANGPT2 aumenta la degradación de la membrana basal vascular y la migración de las células endoteliales, facilitando por lo tanto la formación de brotes. El PDGF, secretado por muchos tumores, puede aumentar su propio receptor (PDGFR) en las células endoteliales. El factor de crecimiento de los fibroblastos básicos (bFGF) es secretado por otros tumores. En respuesta a los reguladores

del crecimiento tales como el VEGF y el bFGF, las células endoteliales producen un aumento regulado de ciertas integrinas. Las integrinas son moléculas de adhesión a la superficie celular que facilitan la unión endotelial a un entorno extracelular, un requerimiento para que las células mantengan la viabilidad y la reactividad a las proteínas reguladoras del crecimiento. Las células endoteliales son las células más dependientes del anclaje. Las integrinas están pensadas para mantener la viabilidad de la célula endotelial durante los desprendimientos intermitentes de células endoteliales que se requieren para migrar hacia un tumor y para aumentar su sensibilidad a los reguladores del crecimiento, tales como el VEGF y el bFGF.

Las integrinas juegan un papel en la angiogénesis tumoral y la metástasis, y otras diversas enfermedades en humanos dependientes de la angiogénesis como la psoriasis y la artritis reumatoide ( (Mousa SA, Drugs of the Future 1998; 23 (1) :51- 60) . Son moléculas de adhesión a la superficie celular que acoplan el entorno extracelular al citoesqueleto (Geiger B. et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2001; 2: 793- 805) . Además de sus funciones estructurales, son receptores para la transmisión de señales importantes para la adhesión, migración, proliferación y supervivencia celular.

Los eventos de señalización inducida por integrinas son múltiples y dependen del contexto celular. La unión de ligandos al dominio de la integrina extracelular induce cambios conformacionales y al agrupamiento de integrinas lo que conduce a la activación de las cascadas de señalización y reclutamiento de complejos multi-proteínas a adhesiones focales (Geiger B. et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2001; 2: 793- 805) . Los mensajes se transmiten a través de una variedad de proteínas quinasas intracelulares y moléculas adaptadoras que incluyen Ras, MAP quinasa (MAPK) , quinasa de adhesión focal (FAK) , Src, Rac/Rho/cdc42 GTPasas, PKC y PI3K. A través de estas moléculas, la señalización de integrinas interactúa de forma cooperativa y cercana con la señalización del receptor tirosina quinasa para regular la supervivencia, proliferación, adhesión y migración (Giancotti FG. et al., Science 1999; 285 (5430) : 1028- 32) .

Las integrinas forman heterodímeros que consisten en dos subunidades, alfa y beta (Hynes RO. Trends Cell Biol 1999; 12: 33- 37) . Se expresan de forma diferenciadora en diversos tipos de células y reconocen múltiples ligandos de las proteínas de la matriz extracelular como el colágeno, vitronectina, fibronectina y laminina. Un subconjunto de integrinas que incluyen alfa (V) beta (3) y alfa (V) beta (5) , reconoce un motivo común en sus ligandos, la secuencia RGD, que está presente en ligandos tales como vitronectina, fibronectina, fibrinógeno (Ruoslahti E. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 1996. 12:697- 715) .

La integrina avº5 se une específicamente a la vitronectina, mientras que la avº3 también se une a otras macromoléculas del ECM provisional. La avº3 se une por ejemplo a ligandos que incluyen fibrina, fibrinógeno, laminina, trombospondina, vitronectina, factor de von Willebrand, osteospontina y sialoproteína ósea I. El papel... [Seguir leyendo]

1. Método ex vivo para la medición del efecto de un inhibidor de la integrina alfa (v) sobre la angiogénesis, en donde el inhibidor de la integrina es mAb DI-17E6 o el péptido RGD cilengitide, y/o la eficacia terapéutica de un inhibidor de ese tipo contra una enfermedad asociada a la angiogénesis, mediante al menos un gen biomarcador específico o un producto génico del mismo seleccionado del grupo que consiste en ADAMTS1, STC1, EDN1, MCP1, IL8, PDGF-BB, CRP, ligando CD40, e IL6, en donde, (i) debido a la administración del respectivo inhibidor de la integrina, ADAMTS1 y STC1 son incrementados de manera regulada y MCP1, EDN1 y PDGF-BB son reducidos de manera regulada, (ii) debido a la administración del cilengitide IL-8 es reducida de manera regulada; y (iii) debido a la administración de DI-17E6, IL8, IL6 y CRP son incrementados de manera regulada, y el ligando CD40 es reducido de manera regulada;

donde el método comprende las siguientes etapas:

(a) medir mediante medios y/o dispositivos técnicos la concentración de referencia y/o el estado de modificación de dicho biomarcador seleccionado en una muestra de un fluido corporal o tejido, mediante el cual se obtiene la muestra de un individuo que no ha sido tratado con dicho inhibidor;

(b) medir mediante medios y/o dispositivos técnicos la concentración y/o el estado de modificación de dichos biomarcadores seleccionados en una muestra de (a) obtenida de un individuo que ha sido tratado con dicho inhibidor o en una muestra de (a) que es tratada en una etapa posterior con dicho inhibidor.

(c) medir mediante medios y/o dispositivos técnicos las diferencias entre las concentraciones y/o el estado de modificación de los biomarcadores seleccionados obtenidos mediante la etapa (a) y (b) ;

(d) determinar a partir de dichas diferencias obtenidas de la etapa (c) una o más de las siguientes propiedades o parámetros de los inhibidores:

-- efectos farmacodinámicos sobre la diana molecular y sobre las respectivas vías de señalización ligadas a la diana molecular,

-- el efecto sobre la angiogénesis,

-- la eficacia del tratamiento y el resultado clínico en un paciente con una enfermedad asociada a la angiogénesis, y de manera opcional

(e) repetir las etapas (a) a (d) hasta que se obtengan las propiedades / parámetros deseados,

permitiendo, de ese modo, la evaluación de las medidas clínicas y actividades con respecto al efecto sobre la angiogénesis o la eficacia terapéutica, seguridad, pronóstico o dosificación de dicho inhibidor, o enfermedades relacionadas con la angiogénesis en un individuo.

2. Método ex vivo según la reivindicación 1, en donde la muestra tomada de fluido corporal es sangre, plasma, suero, linfa, orinal, lágrimas, líquido sinovial, exudado de heridas y/o líquido cefalorraquídeo.

3. Método según la reivindicación 1, en donde la muestra de tejido comprende un tejido enfermo o sano.

4. Método según la reivindicación 1, en donde la muestra de tejido se selecciona del grupo que consiste en tejido cancerígeno, tejido de la piel y/o tejido sinovial.

5. Método ex vivo según la reivindicación 1, en donde se preparan células endoteliales a partir de la muestra de tejido tomada.

6. Método según la reivindicación 5, en donde las células endoteliales se cultivan bajo condiciones de laboratorio después de que han sido obtenidas de un individuo y preparadas a partir de una muestra de tejido, en donde al menos un biomarcador se determina a partir del medio de cultivo celular o extracto de dichas células.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 – 6, en donde la muestra de células endoteliales y/o fluidos corporales se derivan de un individuo sano y/o enfermo que sufre de un trastorno tumoral y/o otra enfermedad asociada a la angiogénesis.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 – 7, en donde la enfermedad asociada a la angiogénesis es cáncer o una enfermedad relacionada con el cáncer.

9. Uso de un gen biomarcador o su producto génico seleccionado del grupo que consiste en ADAMTS1, STC1, EDN1, MCP1, IL8, PDGF-BB, CRP, ligando CD40 e IL6 para evaluar y predecir el efecto del inhibidor de la integrina alfa (v) mAb DI-17E6 o el péptido RGD cilengitide, sobre la angiogénesis en un ensayo basado en células, o la eficacia y / o la dosificación de un inhibidor de ese tipo ex vivo, en donde, (i) debido a la administración del respectivo inhibidor de integrina, ADAMTS1 y STC1 son incrementados de manera regulada, y MCP1, EDN1 y PDGF-BB son reducidos de manera regulada, (ii) debido a la administración de cilengitide, IL8 es reducida de manera regulada; y (iii) debido a la administración de DI-17E6, IL8, IL6 y CRP son incrementados de manera regulada, y el ligando CD40 es reducido de manera regulada.