BACTERIA ACIDO LÁCTICA PROBIÓTICA.

Bacteria acido láctica probiótica.

La presente invención se refiere a las capacidades inhibitorias de una bacteria acido láctica,

de la especie Enterococcus gallinarum con un 99,7% de homología con la cepa tipo LMG 13129, y la forma en que dicha bacteria es usada, incorporada en el alimento, para tratar o prevenir la vibriosis en peces cuando es consumida.

Bacteria acido láctica probiótica

Objeto de la invención La presente invención se refiere a las capacidades inhibitorias de una bacteria acido láctica y la forma en que la bacteria es usada, incorporada en el alimento, para tratar o prevenir la vibriosis en peces cuando es consumida.

Antecedentes de la invención La acuicultura marina ha sido uno de los sectores de la producción animal que más rápidamente han crecido en los últimos treinta años en todo el mundo. Los avances en las tecnologías aplicadas a la acuicultura han permitido un aumento en el volumen de producción, a través de la diversificación de sus actividades con nuevos sistemas de producción y con el cultivo de nuevas especies. Sin embargo, al igual que otros sectores en expansión, la acuicultura se enfrenta actualmente a nuevos retos, que hacen necesaria su reestructuración para lograr una mayor eficiencia y sustentabilidad

El control de los costes de producción se ha convertido en un problema clave para la viabilidad económica de las piscifactorías marinas en el Mediterráneo. En los sistemas de cultivo intensivo y semi intensivos practicados en la región, las enfermedades se presentan a menudo como un factor limitante que puede determinar la rentabilidad de las empresas. Además, nuevos requisitos legales y la demanda por parte de los consumidores de productos más seguros y de mayor calidad, así como la preocupación por la conservación del medioambiente, están reforzando la necesidad de aplicar un enfoque más integrador en la prevención y control de las enfermedades de peces.

Si bien la quimioterapia es quizás el método más rápido para el control de las enfermedad, hay un creciente reconocimiento de su limitaciones en la acuicultura, debido a que ej1 algunos casos, más que proporcionar una solución, puede ocasionar efectos adversos en la salud del animal, mediante la activación de la toxicidad, la resistencia, producción de residuos, etc., dando lugar a consecuencias ambientales y, en ocasiones problemas en la salud pública (F AO, 2002) . Por esta razón la por esta razón la Unión Europea ha planteado serias restricciones sobre el uso de antibióticos en acuicultura. Un diagnóstico rápido y preciso de las enfermedades, la aplicación de medidas preventivas y unos estudios epidemiológicos precisos l~onstituyen la clave para minimizar el impacto de las enfermedades en piscicultura. Por ello, hoy en día las investigaciones se centran en la búsqueda de métodos profilácticos alternativos que sean amigables con el medio ambiente y que contribuyan a una mejor producción, limitando del uso de productos terapéuticos; la introducción de vacunas comerciales ha significado un avance en este sentido, pero en las últimas décadas el uso de probióticos ha despertado gran interés, ya que el beneficio que juegan las bacterias no patógenas para proteger a su hospedador contra infecciones es enorme, así como también han demostrado efectos positivos sobre el crecimiento, supervivencia, en general bienestar en la salud de los animales.

El consumo de la bacteria acido láctica probiótica, objeto de la patente, en forma de producto alimenticio, permite inhibir el crecimiento del patógeno Vibrio anguillarum como tratamiento de la vibriosis en peces.

Sumario de la invención La presente invención se refiere a una cepa bacteriana ácido láctica de la especie Enterococcus gallinarum, que consumida por un animal marino, inhibe el crecimiento del

patógeno Vibrio anguillarum después de 30 días de administración de dicha cepa bacteriana acido láctica; donde el animal marino es escogido de un grupo en el que se encuentra la lubina (Dicentrarchus labrax) , la dorada (Sparus aurata) , la corvina (Argyrosomus regius) y el lenguado (Solea solea) .

También es característico de la invención el uso de dicha cepa bacteriana acido láctica para la fabricación de una composición para el tratamiento de la vibriosis en peces, donde la composición es administrada en forma de producto alimenticio y en una cantidad efectiva, siendo la cantidad efectiva de 108_109 UFC (unidades formadoras de colonia) por gramo de alimento, repartida en al menos dos tomas diarias.

Descripción de las figuras La figura 1 muestra la inhibición del crecimiento frente a Vibrio anguillarum.

Descripción detallada de una realización preferida de la invención Aunque la invención se describe en términos de una realización específica preferida, será fácilmente evidente para los expertos en esta técnica que se pueden hacer diversas modificaciones, redisposiciones y reemplazos. El alcance de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas a la misma.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para el aislamiento de cepas probióticas se utilizaron diversas especies de peces como 60 lubinas (Dicentrarchus labrax) , 80 doradas (Sparus aurata) , 60 corvinas (Argyrosomus regius) y 50 lenguados (Solea solea) siendo muestreados en diferentes épocas del año.

Para el aislamiento de bacterias intestinales empleamos Agar Marino (AM) , Agar Infusión Cerebro Corazón (BHIA) , Agar sangre (AS) , Agar Triptona de Soja (TSA) , y medio Man Rogosa y Sharpe (MRS) , todos ellos de la casa comercial Pronadisa (Conda Laboratorios,

Madrid, España) , preparados según instrucciones del fabricante.

Las placas fueron mantenidas en estufa de 2 a 7 días a 25°C. Posteriormente se resembraron en cultivo puro en TSA y conservadas por liofilización y congelación a -80 oC en BHIB con 15% glicerol para su posterior análisis como posibles cepas probióticas.

Para la caracterización de la cepa como probiótica se analizaron varios mecanismos de selección y se dividio el trabajo en pruebas in vitro e in vivo.

Evaluación in vitro Dentro de la evaluación in vitro tenemos: Efecto inhibitorio del crecimiento Producción de sustancias antibacterianas Resistencia al pH ácidos y a la bilis Competencia por los lugares de adhesión con respecto a los microorganismos patógenos. Efecto inhibitorio del crecimiento frente a patógenos En primer lugar se evaluó el efecto antagónico de todas las cepas bacterianas aisladas frente a diversos patógenos de acuicultura, tanto marina como continental, mediante la metodología descrita por Austin (1992) . En la Tabla 1 observamos el listado de las diferentes cepas patógenas en acuicultura empleados en la experiencia de inhibición del crecimiento. Tablal. Patógenos utilizados en la experiencia de inhibición del crecimiento.

Especie patógena en acuicultura Cepa Origen

Vibrio anguillarum 4347 CECT

Vibrio anguillarum 975-1 CECT

Photobacterium damselae subsp piscicida 94/99 lUSA

Photobacterium damselae subsp piscicida C2 lUSA

Photobacterium damselae subsp piscicida Dl-21 ATCC

Photobacterium damselae subsp piscicida 17911 CECT

Vibrio alginolyticus 521 CECT

Yersinia ruckeri I CECT

Yersinia ruckeri 250 250 CECT

Yersinia ruckeri ppi 661 ppi661 CECT

Yersinia ruckeri 94/05 94/05 CIP

Lactococcus garvieae 102507 lUSA

Streptococcus iniae IUSA-l

CECT: Colección Española de Cultivos Tipo ATCC: Colección Americana de Cultivos Tipo CIP: Colección del Instituto Pasteur lUSA: Instituto Universitario de Sanidad Animal

Todos los patógenos se cultivaron en caldo infusión cerebro corazón (BHIB) durante 24 horas a 25°C para obtener un cultivo en fase exponencial. Posteriormente se centrifugó el medio a 5.000 rpm durante 5 minutos, se retira el sobrenadante y el precipitado se lava 2 veces con PBS estéril, ajustándose a 1 de absorbancia a una longitud de onda de 600nm 10 para obtener una concentración de 109ufc/ml por recuento en placa mediante diluciones seriadas. A partir de esta concentración se realizan diluciones seriadas 1/10 hasta la concentración 107 ufc/ml y sembramos 1 00~1 de esta dilución con ayuda de un asa de Dygraski en placas de TSA. Por otra parte, las cepas a analizar como posibles cepas probióticas se siembran por agotamiento en TSA durante 24 horas a 25°C, tomamos una 15 pequeña muestra con ayuda del asa de siembra y lo depositamos sobre el medio TSA

sembrado previamente con IOOll1 del patógeno, y tras 24-48 horas de incubación, la presencia de halos de inhibición de crecimiento del patógeno alrededor de la posible cepa probiótica a analizar evidencia la existencia de efecto inhibitorio.

Producción de sustancias antibacterianas Una vez detectado efecto inhibitorio del crecimiento de agentes patógenos alrededor de la cepa probiótica analizada, el análisis de la producción de sustancias antibacterianas nos permite evaluar si el efecto inhibitorio observado es debido a sustancias extracelulares que produce la bacteria durante su fase exponencial de... [Seguir leyendo]

1. Una cepa bacteriana ácido láctica de la especie Enterococcus gallinarum, que consumida por un animal marino, inhibe el crecimiento del patógeno Vibrio anguillarum 5 después de 30 días de administración de dicha cepa bacteriana acido láctica.

2. Uso de una cepa bacteriana acido láctica según reivindicación 1, para la fabricación de una composición para el tratamiento de la vibriosis en peces.

3. Uso de una cepa bacteriana acido láctica según reivindicación 2, donde la composición es administrada en forma de producto alimenticio.

4. Uso de una cepa bacteriana acido láctica según reivindicaciones 2 y 3, donde la composición es administrada en una cantidad efectiva, siendo la cantidad efectiva de 108_ 109 UFC (unidades formadoras de colonia) por gramo de alimento, repartida en al menos dos tomas diarias.

5. Uso de una cepa bacteriana acido láctica según reivindicación 2, donde el animal 15 marino es escogido de un grupo en el que se encuentra la lubina (Dicentrarchus labrax) , la dorada (Sparus aurata) , la corvina (Argyrosomus regius) y el lenguado (Solea solea) .

Figura 1