Arabinosa isomerasa termófila de calidad alimentaria expresada a partir de gras, y procedimiento de fabricación de tagatosa mediante el uso de la misma.

Un procedimiento de preparación de arabinosa isomerasa termófila,

de calidad alimentaria, que comprende las etapasde:

preparar un vector recombinante que contiene un gen que codifica arabinosa isomerasa termófila procedente deGeobacillus stearothermophilus DSM 22, insertando dicho gen en el vector transportador pCJ-1 o pHT01, yproduciendo la arabinosa isomerasa termófila a partir de Corynebacterium o Bacillus que son transfectados con elvector recombinante

Arabinosa isomerasa termófila de calidad alimentaria expresada a partir de gras, y procedimiento de fabricación de tagatosa mediante el uso de la misma

Campo técnico

La presente invención se refiere a una arabinosa isomerasa termófila y a un procedimiento de fabricación de tagatosa usando la misma, y, más precisamente, un gen que codifica arabinosa isomerasa procedente del termófilo Geobacillus stearothermophilus DSM22, un vector de expresión recombinante que contiene el gen, a un procedimiento de preparación de una arabinosa isomerasa termófila de calidad alimentaria a partir de la cepa GRAS (Generalmente Reconocida Como Segura) recombinante transformada con dicho vector de expresión, y a un procedimiento de preparación de tagatosa a partir de galactosa, usando dicha enzima.

Antecedentes de la técnica Con el creciente interés en el bienestar o en la vida sana, la tagatosa ha sido propuesta como una alternativa al azúcar, ya que tiene menos efectos secundarios y el azúcar es uno de los principales factores causantes de diversas enfermedades en adultos. La tagatosa es el isómero de la galactosa y se sabe que tiene propiedades fisicoquímicas similares a la fructosa. La tagatosa es un azúcar natural bajo en calorías y, recientemente, ha sido aprobado por la FDA en los EE.UU. como GRAS (Generalmente Reconocido Como Seguro) , de manera que ahora se permite que sea añadida como edulcorante a alimentos, bebidas, alimentos naturales, aditivos dietéticos, etc.

GRAS indica una sustancia que es reconocida generalmente como segura, a juicio de personas especializadas que tienen la experiencia y habilidades suficientes en el examen y los procedimientos científicos en las condiciones indicadas y en el propósito de su uso. GRAS es un sistema único que se usa sólo en los EE.UU. para evaluar la seguridad de alimentos y sustancias químicas alimenticias (bajo ciertas condiciones) , pero es reconocido en todo el mundo.

La tagatosa es producida por isomerización, que es un procedimiento químico que usa un catalizador para producir un isómero, de galactosa o un procedimiento biológico que usa isomerasa para convertir enzimáticamente la galactosa.

Uno de los procedimientos biológicos bien conocidos por las personas con conocimientos en la materia es la conversión de aldosa o derivados de aldosa en cetosa o derivados de aldosa usando una enzima. Generalmente, la isomerización de galactosa en tagatosa usando arabinosa isomerasa se lleva a cabo termodinámicamente, a alta temperatura, y exhibe una tasa de conversión proporcionalmente alta. Por lo tanto, el desarrollo de una enzima que trabaje de manera estable a alta temperatura y un procedimiento de preparación de tagatosa que usa la misma son técnicas clave para su aplicación industrial en base a la conversión biológica de tagatosa usando una isomerasa. Mediante el cribado de arabinosa isomerasas derivadas de termófilos, se ha ensayado una isomerasa termófila de aplicación industrial, y muchos equipos de investigación se han esforzado también en establecer un procedimiento de isomerización usando la misma.

En Corea, Tong Yang Confectioner y Corp. ha desarrollado un procedimiento de isomerización enzimática usando arabinosa isomerasa. Según el procedimiento, un gen de arabinosa isomerasa derivada de E. coli fue expresado en masa en E. coli, usando tecnología recombinante. Esta isomerasa recombinante se hizo reaccionar a 30ºC durante 24 horas para convertir la galactosa en tagatosa y, en este momento, la tasa de conversión fue del 25%, lo que indica que tanto la termoestabilidad como el rendimiento de la transformación eran muy bajos (solicitud de patente coreana No. 99-16118) . El profesor Oh y sus colegas (Sejong University) tuvieron éxito en la expresión en masa de arabinosa isomerasa procedente de Geobacillus stearothermophilus en E. coli, usando tecnología recombinante y, en base a esto, propusieron un procedimiento de isomerización a alta temperatura para convertir galactosa en tagatosa. El equipo de Tong Yang Confectioner y Corp separó una isomerasa termófila de una zona de aguas termales mediante cribado de la biblioteca microorganismos termófilos y, a continuación, la expresaron como una forma activa en un huésped E. coli recombinante para usar galactosa para el procedimiento de isomerización a alta temperatura. De manera similar, CheBiGen Inc. produjo también isomerasa termófila procedente de Geobacillus dinitrificans DBG-A1 en E. coli y desarrolló una técnica para producir tagatosa por inmovilización, usando la misma.

El nivel de expresión de la isomerasa procedente del microorganismo Geobacillus es demasiado bajo para ser aplicado en la industria. La producción de tagatosa usando una arabinosa isomerasa derivada de termófilo todavía depende del procedimiento de uso de una enzima recombinante expresada en masa en E. coli recombinante o la isomerización de galactosa en tagatosa usando un huésped que contiene la enzima recombinante. Sin embargo, esta producción biotecnológica de tagatosa usando E. coli recombinante no es apropiada para la producción de tagatosa como un material alimenticio. Para producir tagatosa como un aditivo alimenticio, la arabinosa isomerasa expresada en un huésped que es un microorganismo GRAS apropiado para la producción en masa de la misma, es esencial.

Los microorganismos GRAS aplicables industrialmente para la producción de una enzima recombinante pueden ser seleccionados de entre un grupo que consiste en Bacillus sp., Cor y nebacterium sp, y Lactobacillus sp. Es fácil manipular los genes de cepas de Bacillus sp. y Cor y nebacterium sp. para la industrialización y el cultivo en masa, y son altamente estables bajo diversas condiciones. De hecho, entre los microorganismos GRAS, principalmente las cepas Bacillus sp. y Cor y nebacterium sp. han sido usadas como un huésped para la producción de una enzima recombinante.

Los presentes inventores tuvieron éxito en la expresión de arabinosa isomerasa termófila procedente de Geobacillus como una forma activa en microorganismos GRAS, tales como cepas de Bacillus sp. y Cor y nebacterium sp. Los presentes inventores establecieron también un procedimiento para inducir isomerización de galactosa en tagatosa a alta concentración usando dicha enzima recombinante de GRAS expresada.

Divulgación de la invención

Problema técnico Un objeto de la presente invención es expresar arabinosa isomerasa procedente de un termófilo como una forma activa a partir de microorganismos GRAS y proporcionar un procedimiento de preparación de tagatosa de calidad alimentaria mediante la isomerización de galactosa.

Solución técnica El objeto anterior y otros objetos de la presente invención pueden conseguirse mediante las realizaciones siguientes de la presente invención.

Para conseguir los objetos anteriores, los presentes inventores produjeron una enzima recombinante de calidad alimentaria mediante la introducción de un gen de arabinosa isomerasa termófila derivada del termófilo Geobacillus stearothermophilus en un microorganismo GRAS y, de esta manera, produjeron tagatosa a partir de galactosa.

A continuación, la presente invención se describe en detalle.

Preferentemente, los microorganismos GRAS (Generalmente Reconocidos Como Seguros) de la presente invención incluyen cepas de Bacillus sp. y Cor y nebacterium sp., y Cor y nebacterium glutamicum KCTC 13032 y Bacillus subtilis 168 son más preferentes.

Preferentemente, el gen de arabinosa isomerasa de la presente invención procede de un termófilo y, más preferentemente, de Geobacillus stearothermophilus DSM22.

El gen de arabinosa isomerasa de la presente invención puede ser modificado por las personas con conocimientos en la materia usando cualquier procedimiento de mutagénesis convencional, tal como evolución dirigida y mutagénesis dirigida al sitio. De esta manera, cualquier célula huésped que tenga un cierto nivel de homología con un huésped GRAS, por ejemplo, una homología de al menos el 70%, pero preferentemente de al menos el 80% y, más preferentemente, de al menos el 90% con un huésped GRAS, una enzima recombinante que es expresada como un forma activa en el huésped y cualquiera célula huésped que contiene la enzima, están incluidos todos ellos en los criterios de la presente invención.

Las realizaciones de la presente invención proporcionan también un vector que contiene un gen que codifica la arabinosa isomerasa de la presente invención. El vector de la presente invención es un vector típico para la clonación o la expresión. El vector no está limitado a un vector específico y cualquier vector conocido por las personas con conocimientos en la materia es aceptable.

En la presente invención,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de preparación de arabinosa isomerasa termófila, de calidad alimentaria, que comprende las etapas de:

preparar un vector recombinante que contiene un gen que codifica arabinosa isomerasa termófila procedente de Geobacillus stearothermophilus DSM 22, insertando dicho gen en el vector transportador pCJ-1 o pHT01, y produciendo la arabinosa isomerasa termófila a partir de Cor y nebacterium o Bacillus que son transfectados con el vector recombinante.

2. Procedimiento de preparación de arabinosa isomerasa termófila, de calidad alimentaria, según la reivindicación 1, en el que Bacillus es Bacillus subtilis GSAIB-1 (Nº de acceso KCCM 10788P) .

3. Procedimiento de preparación de arabinosa isomerasa termófila, de calidad alimentaria, según la reivindicación 1, en el que Cor y nebacterium es Cor y nebacterium glutamicum GSAIC-1 (Nº de acceso KCCM 10789P) .