Aparato para llevar a cabo la PCR y monitorización de la reacción en tiempo real durante ciclos de temperatura.

Aparato para llevar a cabo una PCR y control fluorescente continuo de la reacción de PCR y para someter unamuestra biológica a ciclos térmicos rápidos con la finalidad de llevar a cabo la reacción de PCR,

estando adaptado elaparato para generar una curva de fusión de un producto de la reacción de PCR; en el que

el aparato comprende un medio para soportar la muestra biológica;

la muestra comprende además una entidad fluorescente y una mezcla de reacción para la reacción de la cadena depolimerasa;

comprendiendo el aparato un controlador para el funcionamiento del aparato, para permitir que la muestra biológicapase por un ciclo de temperatura predeterminado que corresponde a las etapas de desnaturalización, hibridación yalargamiento de la reacción PCR;

una fuente de excitación fluorescente para excitar ópticamente la muestra para provocar su fluorescencia:

un fotodetector para detectar niveles de fluorescencia desde la muestra; y

un ordenador configurado para enviar la curva de fusión del producto de la reacción PCR de manera que sondistinguibles los productos de diferente longitud y diferente contenido de GC.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10174616.

Solicitante: UNIVERSITY OF UTAH RESEARCH FOUNDATION.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 210 Park Building Salt Lake City, Utah 84112 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: WITTWER, CARL, T., RIRIE, KIRK M..

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • B01L3/14 SECCION B — TECNICAS INDUSTRIALES DIVERSAS; TRANSPORTES.B01 PROCEDIMIENTOS O APARATOS FISICOS O QUIMICOS EN GENERAL.B01L APARATOS DE LABORATORIO PARA LA QUIMICA O LA FISICA, DE USO GENERAL (aparatos de uso médico o farmacéutico A61; aparatos para aplicaciones industriales o aparatos de laboratorio cuya estructura y funciones son comparables a las de aparatos industriales similares, ver las clases relativas a los aparatos industriales, en particular las subclases B01 y C12; aparatos de separación o de destilación B01D; dispositivos de mezcla o de agitación B01F; atomizadores B05B; tamices, cribas B07B; tapones, capuchones B65D; manipulación de líquidos en general B67; bombas de vacío F04; sifones F04F 10/00; grifos, válvulas F16K; tubos, empalmes para tubos F16L; aparatos especialmente adaptados al estudio y análisis de materiales G01, particularmente G01N; aparatos eléctricos u ópticos, ver las subclases apropiadas en las secciones G y H). › B01L 3/00 Recipientes o utensilios para laboratorios, p. ej. cristalería de laboratorio (botellas B65D; equipos para enzimología o microbiología C12M 1/00 ); Cuentagotas (recipientes para volumetría G01F). › Tubos de ensayo.
  • B01L7/00 B01L […] › Aparatos de calentamiento o de enfriamiento (evaporadores B01D 1/00; secado de gases o vapores, p. ej. desecadores, B01D 53/26; autoclaves B01J 3/04; hornos de secado F26B; altos hornos, hornos F27 ); Dispositivos de aislamiento térmico.
  • B01L9/00 B01L […] › Dispositivos de soporte; Dispositivos de sujeción (tenacillas, pinzas B25B).
  • C12N15/09 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • G01N21/03 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 21/00 Investigación o análisis de los materiales por la utilización de medios ópticos, es decir, utilizando rayos infrarrojos, visibles o ultravioletas (G01N 3/00 - G01N 19/00 tienen prioridad). › Detalles estructurales de las cubetas.
  • G01N21/07 G01N 21/00 […] › Cubetas de tipo centrífugo (G01N 21/09 tiene prioridad).
  • G01N21/25 G01N 21/00 […] › Color; Propiedades espectrales, es decir, comparación del efecto del material sobre la luz para varias longitudes de ondas o varias bandas de longitudes de ondas diferentes.
  • G01N21/64 G01N 21/00 […] › Fluorescencia; Fosforescencia.
  • G01N21/76 G01N 21/00 […] › Quimicoluminiscencia; Bioluminiscencia.
  • G01N21/78 G01N 21/00 […] › produciendo un cambio de color.
  • G01N33/50 G01N […] › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre, de orina; Investigación o análisis por métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Investigación o análisis inmunológico (procedimientos de medida, de investigación o análisis diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto; procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
  • G01N33/58 G01N 33/00 […] › en los que intervienen sustancias marcadas (G01N 33/53 tiene prioridad).
  • G01N35/00 G01N […] › Análisis automático no limitado a procedimientos o a materiales tratados en uno sólo de los grupos G01N 1/00 - G01N 33/00; Manipulación de materiales a este efecto.
  • G01N35/02 G01N […] › G01N 35/00 Análisis automático no limitado a procedimientos o a materiales tratados en uno sólo de los grupos G01N 1/00 - G01N 33/00; Manipulación de materiales a este efecto. › utilizando una serie de recipientes con muestras desplazadas por un transportador que pasa delante de uno o más puestos de tratamiento o análisis.

PDF original: ES-2434258_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Aparato para llevar a cabo la PCR y monitorización de la reacción en tiempo real durante ciclos de temperatura ANTECEDENTES

1. Sector técnico al que pertenece la invención

La presente invención se refiere de modo general a aparatos que se utilizan para llevar a cabo procesos biológicos, tales como la reacción de la cadena de polimerasa. De manera más específica, la presente invención se refiere a aparatos y métodos que llevan a cabo el ciclo térmico y la supervisión de diferentes reacciones biológicas, tales como la reacción de la cadena de polimerasa.

2. Antecedentes técnicos

En numerosas áreas industriales, de la tecnología y de la investigación existe la necesidad de someter de manera fiable y reproducible ciertas muestras a un ciclo térmico. La necesidad de someter una muestra a ciclos térmicos repetidos es particularmente aguda en aplicaciones de biotecnología. En el sector de la biotecnología, es deseable frecuentemente calentar y enfriar repetidamente pequeñas muestras de materiales a lo largo de un corto período de tiempo. Uno de los procesos biológicos que es llevado a cabo regularmente es la amplificación cíclica de ADN.

La amplificación cíclica de ADN utilizando polimerasa de ADN termoestable permite una amplificación automatizada del cebador específico de ADN, conocido ampliamente como “reacción de la cadena de polimerasa” o “PCR”. La automatización de este procedimiento requiere un ciclo térmico preciso y controlado de las mezclas de reacción usualmente contenidas en una serie de contenedores. Con anterioridad, el contenedor preferente ha sido un tubo micrófugo estándar de material plástico.

Se han utilizado bloques térmicos, metálicos, programables de tipo comercial con anterioridad para llevar a cabo el ciclo de temperatura de muestras en tubos micrófugos según la variación deseada de temperatura con respecto al tiempo. No obstante, la imposibilidad de ajustar de manera rápida y exacta la temperatura de los bloques térmicos en una amplia gama de temperaturas en un corto período de tiempo, ha hecho poco deseable la utilización de dispositivos del tipo de bloques térmicos como sistema de control térmico cuando se llevan a cabo procesos tales como reacción de la cadena de polimerasa.

Además, los tubos micrófugos que se han utilizado de modo general tienen desventajas. El material de los tubos micrófugos, su grosor de paredes y la geometría de tubos micrófugos es un inconveniente para el calentamiento y enfriamiento rápidos de las muestras contenidas en los mismos. El material plástico y el grosor de pared de los tubos micrófugos actúan como aislante entre la muestra contenida y el medio circundante dificultando por esta razón la transferencia de energía térmica. Asimismo, la geometría del tubo micrófugo presenta una pequeña área superficial a cualquiera de los medios utilizados para la transferencia de la energía térmica. La utilización continuada de tubos micrófugos en esta técnica, con su geometría que no es óptima, indica que las ventajas de la transferencia térmica mejorada (que se consiguen al aumentar el área superficial de un contenedor de muestras para una muestra de volumen constante) no se han reconocido hasta el momento.

Además, también se han utilizado dispositivos que utilizan baños de agua con conmutación fluídica (o transferencia mecánica) como dispositivo de ciclo térmico para la reacción de cadena de polimerasa. Si bien se han utilizado baños de agua en el ciclo de la mezcla de reacción de la cadena de polimerasa de acuerdo con una variación deseada de temperatura con respecto al tiempo necesario para que tenga lugar la reacción, la elevada masa térmica del agua (y la baja conductividad térmica de los tubos micrófugos de plástico) ha sido un aspecto significativamente limitativo en cuanto al comportamiento del aparato y a la especificidad de la reacción.

Los dispositivos que utilizan baños de agua tienen un rendimiento limitado. La causa de ello es que la masa térmica del agua restringe significativamente el gradiente de temperatura máxima con respecto al tiempo que se puede alcanzar. Asimismo, el aparato con baño de agua se ha observado que es muy engorroso debido a las dimensiones y número de tubos portadores de agua y dispositivos externos de control de temperatura del agua. Además, la necesidad de excesivo mantenimiento periódico e inspección de los racores para el agua a efectos de detectar fugas en aparatos con baño de agua es dificultosa y requiere mucho tiempo. Finalmente, es difícil con aparatos con baño de agua controlar la temperatura en los tubos de muestra con la exactitud que sería de desear.

La Patente U.S.A. Nº 3.616.264 de Ray muestra un aparato térmico de aire forzado destinado a efectuar el ciclo del aire para calentar o enfriar muestras biológicas a una temperatura constante. Si bien el dispositivo de Ray es más o menos eficaz en el mantenimiento de una temperatura constante dentro de la cámara de aire, no se adapta a la necesidad de ajustar rápidamente la temperatura de forma cíclica de acuerdo con la variación de temperatura con respecto al tiempo requerida para procesos biológicos tales como la reacción de la cadena de polimerasa.

Las Patentes U.S.A. Nº 4.420.679 de Howe y Nº 4.286.456 de Sisti y otros dan a conocer estufas cromatográficas de gas. Los dispositivos que se dan a conocer en dichas patentes Howe y Sisti y otros son adecuados para llevar a cabo procedimientos de cromatografía gaseosa pero no proporcionan capacidad de realización de ciclos térmicos que sea significativamente más rápida que lo que se consigue por cualquiera de los dispositivos que se han descrito. La realización de ciclos térmicos rápidos es útil para llevar a cabo muchos procedimientos. Dispositivos tales como los que se describen en dichas patentes Howe y Sisti y otros no son adecuados para llevar a cabo de manera rápida y eficaz las mencionadas reacciones.

Los documentos EP0580362A, EP0640828A y la publicación de Higuchi y otros, Biotechnology, vol. 11, págs. 10261030, (1993) dan a conocer aparatos para el control de reacciones PCR múltiples por el control de la fluorescencia de moléculas fluorescentes en la mezcla de reacción.

En particular, la reacción de cadena de polimerasa (PRC) es una técnica de amplificación fundamental de ADN esencial en la biología molecular moderna. A pesar de su carácter útil y su popularidad, el conocimiento actual de la PCR no es muy avanzado. Se deben optimizar las amplificaciones por pruebas sucesivas y los protocolos son seguidos frecuentemente de forma ciega. La comprensión limitada de la PCR que se observa en la técnica actual es un buen ejemplo de la forma en la que los actuales técnicos en la materia se conforman en utilizar una técnica potente sin reflexión ni comprensión.

Los procesos biológicos, tales como la PCR, requieren la realización de ciclos de temperatura con la muestra. La técnica anterior, tal como se ha explicado anteriormente, no solamente lleva a cabo los ciclos de temperatura lentamente, sino que ignora los principios que subyacen y que permiten el funcionamiento de la PCR y que se podrían utilizar para hacer la PCR incluso más potente. Así por ejemplo, sería un gran progreso en esta técnica el dar a conocer métodos y aparatos que son particularmente adaptables para llevar a cabo rápidamente la PCR y para el análisis de la reacción que está teniendo lugar, especialmente si dicha reacción es analizada mientras está teniendo lugar, es decir, en tiempo real.

BREVE RESUMEN Y OBJETIVOS DE LA INVENCIÓN

Teniendo en cuenta el estado de la técnica anteriormente descrita, la presente invención está destinada a conseguir los siguientes objetivos y ventajas.

Se da a conocer un aparato para el control preciso de la temperatura de muestras biológicas.

Se da a conocer además un sistema y procedimiento para llevar a cabo PCR rápidamente y controlar asimismo, de manera continua, la reacción mientras se está realizando.

De acuerdo con la presente invención, se da a conocer un aparato, según las reivindicaciones, para llevar a cabo la PCR y el control fluorescente continuo de la reacción PCR y para someter una muestra biológica a ciclos térmicos rápidos para llevar a cabo la reacción PCR; en la que;

el aparato comprende un medio para soportar la muestra biológica;

la muestra comprende además una entidad fluorescente y una mezcla de reacción para la reacción de la cadena de polimerasa;

comprendiendo el aparato un controlador para el accionamiento del aparato para permitir que la muestra biológica pase a través de un ciclo de temperatura predeterminado que corresponde... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Aparato para llevar a cabo una PCR y control fluorescente continuo de la reacción de PCR y para someter una muestra biológica a ciclos térmicos rápidos con la finalidad de llevar a cabo la reacción de PCR, estando adaptado el 5 aparato para generar una curva de fusión de un producto de la reacción de PCR; en el que el aparato comprende un medio para soportar la muestra biológica;

la muestra comprende además una entidad fluorescente y una mezcla de reacción para la reacción de la cadena de 10 polimerasa;

comprendiendo el aparato un controlador para el funcionamiento del aparato, para permitir que la muestra biológica pase por un ciclo de temperatura predeterminado que corresponde a las etapas de desnaturalización, hibridación y alargamiento de la reacción PCR;

una fuente de excitación fluorescente para excitar ópticamente la muestra para provocar su fluorescencia:

un fotodetector para detectar niveles de fluorescencia desde la muestra; y

un ordenador configurado para enviar la curva de fusión del producto de la reacción PCR de manera que son distinguibles los productos de diferente longitud y diferente contenido de GC.

2. Aparato, según la reivindicación 1, en el que la entidad fluorescente comprende un par de sondas de oligonucleótidos. 25

3. Aparato, según la reivindicación 1, en el que la entidad fluorescente es un colorante específico de ADN de doble cadena.

4. Aparato, según la reivindicación 3, en el que el colorante específico de ADN de doble cadena es SYBRF Green I 30 o bromuro de etidio.

5. Aparato, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende medios para retener energía térmica y medios para el calentamiento de la muestra.

6. Aparato, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende medios para transportar aire caliente

o frío hacia adentro o hacia fuera del aparato.

. Aparato, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, configurado para aumentar o disminuir la

temperatura de la muestra a una velocidad de, como mínimo, 1, 0 ºC/segundo. 40

8. Aparato, según la reivindicación 1, en el que el ordenador capta además la Tm de la sonda.


 

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