Análisis de fusión de ácidos nucleicos con colorantes de saturación.

Mezcla de reacción de PCR que comprende

un ácido nucleico diana

reactivos de PCR,

un par de cebadores de oligonucleótidos configurados para amplificar una parte del ácido nucleico diana para producir un amplicón, y

un colorante de unión a ADNdc que tiene la fórmula:**Fórmula**

en la que

el residuo representa un anillo aromático, monocíclico o policíclico, fusionado, opcionalmente sustituido o un anillo heteroaromático que contiene nitrógeno, monocíclico o policíclico, fusionado, opcionalmente sustituido;

X es oxígeno, azufre, selenio, telurio o un residuo seleccionado entre C(CH3)2 y NR1, en el que R1 es hidrógeno o alquilo C1-6;

R2 se selecciona del grupo que comprende alquilo C1-6, cicloalquilo C3-8, arilo, arilo(alquilo C1-3), hidroxialquilo, alcoxialquilo, aminoalquilo, mono y dialquilaminoalquilo, trialquilamonioalquilo, alquilencarboxilato, alquilencarboxamida, alquilensulfonato, residuos que contienen un heteroátomo cíclico opcionalmente sustituido, o residuos que contienen un heteroátomo acíclico opcionalmente sustituido;

t ≥ 0 ó 1;

Z es una carga seleccionada entre 0 y 1;

R3, R9 y R10 se seleccionan independientemente del grupo que comprende hidrógeno, alquilo C1-6 y arilcarbonilo; n ≥ 0, 1 ó 2; y

Q es un heterociclo seleccionado del grupo de estructuras que comprende:**Fórmula**

en el que R5, R6, R7 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que comprende hidrógeno, halógeno, alquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, heterocicloalquilo, alquenilo, polialquenilo, alquinilo, polialquinilo, alquenilalquinilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, alquiltio, ariltio, arilcarboniltio, dialquilamino, cicloheteroalquilcarboniltio, dialquilaminoalquilcarboniltio, trialquilamonioalquilcarboniltio, cicloalquiltio, cicloheteroalquiltio, trialquilamonioalquiltio y nucleosidiltio, cada uno de los cuales puede estar sustituido opcionalmente; un residuo que contiene un heteroátomo acíclico, o un residuo que contiene un heteroátomo cíclico, una unión PUENTE-COLORANTE con la fórmula:**Fórmula**

en el que el PUENTE es un enlace covalente simple, o un enlace covalente lineal o ramificado, cíclico o heterocíclico, saturado o insaturado, que tiene 1-16 átomos diferentes al hidrógeno, tales como carbono, nitrógeno, fosfato, oxígeno y azufre, de tal forma que la unión contiene cualquier combinación de enlaces alquilo, éter, tioéter, amina, éster o amida; enlaces carbono-carbono simples, dobles, triples o aromáticos; enlaces fósforo-oxígeno, fósforoazufre, nitrógeno-nitrógeno o nitrógeno-oxígeno; o enlaces aromáticos o heteroaromáticos;

y un grupo reactivo seleccionado entre halógenos, hidroxi, alcóxidos, aminas, ácidos carboxílicos, haluros, alcoholes, aldehídos, tioles, alquilo y ariltioles, alquilo y arilsulfonilos, ésteres de succinimidilo, cetonas e isotiocianatos;

cada uno de los cuales comprende opcionalmente un residuo de amonio cuaternario, y

R4 se selecciona del grupo que comprende arilcarboniltio, cicloheteroalquilcarboniltio, dialquilaminoalquilcarboniltio; trialquilamonioalquilcarboniltio, cicloalquiltio, cicloheteroalquiltio, trialquilamonioalquiltio, alquilnitriltio, y nucleosidiltio, cada uno de los cuales puede estar sustituido opcionalmente.

Análisis de fusión de ácidos nucleicos con colorantes de saturación SECTOR DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a colorantes de unión a ácidos nucleicos de doble cadena y métodos para llevar a cabo el análisis de ácidos nucleicos en presencia de un colorante de unión a ácidos nucleicos de doble cadena.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los métodos para analizar variaciones en las secuencias de ADN se pueden dividir en dos categorías generales: 1) genotipado de variantes de secuencia conocidas y 2) cribado de variantes desconocidas. Existen diversos métodos para genotipar variantes se secuencia conocidas, y métodos de una sola etapa, homogéneos, en tubo cerrado que utilizan sondas fluorescentes (Lay MJ, y otros, Clin. Chem. 1997; 43:2262-7) . En cambio, la mayoría de técnicas de cribado de las variantes desconocidas precisan de electroforesis de gel o de separación en columna tras la PCR. Dichas técnicas incluyen polimorfismos de conformación de una única cadena (Orita O, y otros, Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86:2766-70) , migración de heterodúplex (Nataraj AJ, y otros, Electrophoresis 1999; 20:1177-85) , electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (Abrams ES, y otros, Genomics 1990; 7:463-75) , electroforesis en gel con gradiente de temperatura (Wartell RM y otros, J Chromatogr A 1998; 806:169-85) , métodos de división enzimática o química (Taylor GR, y otros, Genet Anal 1999; 14:181-6) , así como la secuenciación de ADN. La identificación de nuevas mutaciones mediante secuenciación también requiere varios pasos tras realizar la PCR, concretamente la secuenciación del ciclo y electroforesis en gel. La cromatografía líquida de alto rendimiento en condiciones desnaturalizantes (Xiao W, y otros, Hum Mutat 2001; 17:439-74) incluye la inyección del producto de la PCR en una columna.

Recientemente, se han utilizado métodos homogéneos de fluorescencia en el cribado de mutaciones. El SYBR® Green I (Molecular Probes, Eugene, Oregon) es un colorante específico para ADN de doble cadena que se utiliza a menudo para hacer un seguimiento de la formación de producto (Wittwer CT, y otros, BioTechniques 1997; 22:130-8) y la temperatura de fusión (Ririe KM, y otros, Anal. Biochem 1997; 245:154-60) con PCR en tiempo real. Se ha podido detectar la presencia de cambios heterocigóticos de una sola base en productos de hasta 167 pb mediante análisis de la curva de fusión con SYBR® Green I (Lipsky RH, y otros, Clin Chem 2001; 47:635-44) . Sin embargo, posteriormente a la amplificación y previamente al análisis de fusión, se purificó el producto de la PCR y se añadieron elevadas concentraciones de SYBR® Green I. La concentración de SYBR® Green I que se utiliza para la detección en este método inhibe la PCR (Wittwer CT y otros, BioTechniques 1977; 22:130-1, 134-8) ; por ese motivo, el colorante se añadió tras la amplificación. Sería adecuado un colorante que se pudiera utilizar para detectar la presencia de variaciones genéticas, incluidos los cambios heterocigóticos de una sola base y que a su vez se pudiera añadir previamente a la PCR.

Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) son ampliamente la variación genética más observada en el ser humano y otras especies. En dichos polimorfismos, entre dos individuos solo varía una única base. Esta modificación puede llevar al cambio de un aminoácido en una proteína, alterar las tasas de transcripción, afectar el corte y empalme del ARNm o no tener ningún efecto aparente en los procesos celulares. En ocasiones, cuando este cambio es silencioso (por ejemplo, cuando el aminoácido por el que codifica no cambia) , el genotipado de los SNP puede seguir siendo valioso si la modificación está relacionada (asociada) con un único fenotipo provocado por otra alteración genética.

Existen varios métodos para el genotipado de SNP. La mayoría de ellos utilizan la PCR u otras técnicas de amplificación para amplificar el molde que se está estudiando. Se pueden utilizar técnicas contemporáneas o posteriores, incluyendo la electroforesis en gel, la espectrometría de masas y la fluorescencia. Las técnicas de fluorescencia resultan adecuadas ya que son homogéneas y no precisan de la adición de reactivos tras el inicio de la amplificación o del muestreo físico de las reacciones para realizar el análisis. Algunos ejemplos de técnicas homogéneas utilizan cebadores de oligonucleótidos para localizar la región que se estudia, y etiquetas fluorescentes o colorantes para generar señales. Métodos ilustrativos basados en PCR son tubos completamente cerrados, utilizan una enzima termoestable que es estable a la temperatura de desnaturalización del ADN, de manera que no hace falta añadir más compuestos tras empezar el aumento de temperatura.

Se pueden utilizar varios métodos de PCR en tubo cerrado, homogéneos y fluorescentes para el genotipado de los SNP. Dichos métodos incluyen sistemas que utilizan sondas de oligonucleótidos FRET con dos cromóforos que interactúan (sondas de hibridación adyacente, sondas Taq Man, Molecular Beacons, Scorpions) , sondas de un único oligonucleótido con un solo fluoróforo (sondas G-quenching, Crockett, A.O. y C. T. Wittwer, Anal. Biochem. 2001; 290:89-97 y SimpleProbes, Idaho Technology) , y técnicas que utilizan un colorante de ADNdc, en lugar de sondas de oligonucleótidos marcados covalentemente con fluorescencia. Las técnicas de tinción son adecuadas porque no precisan sondas de oligonucleótidos con marcaje, con lo que se reduce el tiempo de diseño y el coste de los ensayos.

Se han publicado dos técnicas para clasificar SNP mediante la utilización de colorantes de ADNdc. Se puede utilizar amplificación específica de alelo en presencia de colorantes de ADNdc para genotipar con PCR en tiempo real (Germer S, y otros, Genome Research 2000; 10:258-266) . Según el método de la referencia de Germer, dos cebadores específicos de alelo se diferencian en su base 3’ y amplifican de forma diferencial un alelo o el otro en presencia de un cebador antisentido común. A pesar de que no se necesitan oligonucleótidos marcados con fluorescencia, para el genotipado se precisan tres cebadores y dos pocillos para cada genotipo de SNP. Además, es necesario un instrumento de PCR en tiempo real para hacer un seguimiento de la fluorescencia en cada ciclo.

El otro método basado en tinción no precisa de un seguimiento en tiempo real, solamente necesita un pocillo por cada genotipo de SNP y utiliza el análisis de fusión (Germer S, y otros, Genome Research 1999; 9:72-79) . En este método también se utiliza la amplificación específica de alelo, que precisa de tres cebadores, tal y como sucedía con el método Germer citado previamente. Además, uno de los cebadores incluye cola de anclaje GC (“GC-clamp tail”) para aumentar la temperatura de fusión de un amplicón, permitiendo así la diferenciación mediante temperatura de fusión en un pocillo, Se hace un seguimiento de la fluorescencia tras la amplificación mediante PCR, y la adquisición en tiempo real no es necesaria.

T. ISHIGURO y otros en Anal. Biochem. 229, 207 (1995) dan a conocer un ensayo basado en una reacción en cadena de la polimerasa que se lleva a cabo en presencia de un intercalador fluorescente, el colorante de monometino YO-PRO-1.

MOREDA y otros en Tetrahedron 53/37, 12595 (1997) y Tetrahedron 53/37, 12605 (1997) dan a conocer colorantes de cianina como marcadores de ADN que contienen una estructura parcial de purina.

CARACTERÃ?STICAS DE LA INVENCIÓN

La presente invención se define en las reivindicaciones. Se da a conocer un método que solamente precisa de una mezcla de PCR estándar, que incluye reactivos, cebadores, y la simple adición previa a la PCR de un colorante de unión al ADN (dc) de doble cadena “saturante” o un nuevo colorante de unión a ADNdc según la presente descripción. Para los propósitos de la presente memoria descriptiva, un colorante “saturante” es un colorante que no inhibe significativamente la PCR cuando se encuentra en concentraciones que proporcionan una señal de fluorescencia máxima en el caso de la cantidad de ADNdc que se genera normalmente mediante una PCR en ausencia de colorante, a modo de ejemplo, de aproximadamente 10 ng/μl. A pesar de que los colorantes se identifican por su compatibilidad con el procedimiento de PCR a concentraciones cercanas a la saturación, se comprende que dichos colorantes se pueden utilizar a concentraciones muy inferiores. Durante el proceso de amplificación o después del mismo, los colorantes se pueden utilizar para distinguir heterodúplex y homodúplex mediante el análisis de la curva de fusión de un modo similar a como se utiliza el marcaje de los cebadores.... [Seguir leyendo]

1. Mezcla de reacción de PCR que comprende un ácido nucleico diana reactivos de PCR, un par de cebadores de oligonucleótidos configurados para amplificar una parte del ácido nucleico diana para producir un amplicón, y un colorante de unión a ADNdc que tiene la fórmula:

en la que el residuo representa un anillo aromático, monocíclico o policíclico, fusionado, opcionalmente sustituido o un anillo heteroaromático que contiene nitrógeno, monocíclico o policíclico, fusionado, opcionalmente sustituido; X es oxígeno, azufre, selenio, telurio o un residuo seleccionado entre C (CH3) 2 y NR1, en el que R1 es hidrógeno o alquilo C1-6;

R2

se selecciona del grupo que comprende alquilo C1-6, cicloalquilo C3-8, arilo, arilo (alquilo C1-3) , hidroxialquilo, alcoxialquilo, aminoalquilo, mono y dialquilaminoalquilo, trialquilamonioalquilo, alquilencarboxilato, alquilencarboxamida, alquilensulfonato, residuos que contienen un heteroátomo cíclico opcionalmente sustituido, o residuos que contienen un heteroátomo acíclico opcionalmente sustituido; t =0ó 1; Z es una carga seleccionada entre 0 y 1; R3, R9 y R10 se seleccionan independientemente del grupo que comprende hidrógeno, alquilo C1-6 y arilcarbonilo; n =0, 1ó 2; y Q es un heterociclo seleccionado del grupo de estructuras que comprende:

en el que R5, R6, R7 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que comprende hidrógeno, halógeno, alquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, heterocicloalquilo, alquenilo, polialquenilo, alquinilo, polialquinilo, alquenilalquinilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, alquiltio, ariltio, arilcarboniltio, dialquilamino, cicloheteroalquilcarboniltio, dialquilaminoalquilcarboniltio, trialquilamonioalquilcarboniltio, cicloalquiltio, cicloheteroalquiltio, trialquilamonioalquiltio y nucleosidiltio, cada uno de los cuales puede estar sustituido opcionalmente; un residuo que contiene un heteroátomo acíclico, o un residuo que contiene un heteroátomo cíclico, una unión PUENTE-COLORANTE con la fórmula:

en el que el PUENTE es un enlace covalente simple, o un enlace covalente lineal o ramificado, cíclico o heterocíclico, saturado o insaturado, que tiene 1-16 átomos diferentes al hidrógeno, tales como carbono, nitrógeno, fosfato, oxígeno y azufre, de tal forma que la unión contiene cualquier combinación de enlaces alquilo, éter, tioéter, amina, éster o amida; enlaces carbono-carbono simples, dobles, triples o aromáticos; enlaces fósforo-oxígeno, fósforoazufre, nitrógeno-nitrógeno o nitrógeno-oxígeno; o enlaces aromáticos o heteroaromáticos; y un grupo reactivo seleccionado entre halógenos, hidroxi, alcóxidos, aminas, ácidos carboxílicos, haluros, alcoholes, aldehídos, tioles, alquilo y ariltioles, alquilo y arilsulfonilos, ésteres de succinimidilo, cetonas e isotiocianatos; cada uno de los cuales comprende opcionalmente un residuo de amonio cuaternario, y R4 se selecciona del grupo que comprende arilcarboniltio, cicloheteroalquilcarboniltio, dialquilaminoalquilcarboniltio; trialquilamonioalquilcarboniltio, cicloalquiltio, cicloheteroalquiltio, trialquilamonioalquiltio, alquilnitriltio, y nucleosidiltio, cada uno de los cuales puede estar sustituido opcionalmente.

2. Mezcla de reacción de PCR, según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una sonda sin marcaje configurada para hibridarse, como mínimo, a una parte del amplicón.