Anticuerpos monoclonales anti-anexina A3 para la detección de carcinoma de próstata.

Un método in vitro para el diagnóstico de cáncer de próstata, en el que una muestra se analiza en cuanto a lapresencia y/o cantidad de anexina A3 con un anticuerpo específico para anexina A3 que no tiene esencialmentereactividad cruzada alguna contra otras anexinas, en el que el anticuerpo se produce por la línea de células dehibridoma tgc 7 ProVII5C5, DSM ACC2780, o un anticuerpo que se une al mismo epítopo sobre anexina A3.

Anticuerpos monoclonales anti-anexina A3 para la detección de carcinoma de próstata La presente invención se refiere a un método para el diagnóstico de carcinoma de próstata, que comprende la determinación de anexina A3, particularmente de anexina A3 extracelular con anticuerpos altamente específicos, particularmente con anticuerpos monoclonales. La presente invención se refiere, además, a un reactivo de ensayo que comprende este tipo de anticuerpos.

En los hombres, el carcinoma de próstata figura primero entre las incidencias malignas y, a pesar de una agresividad biológica moderada en comparación con otras entidades tumorales, en segundo lugar entre muertes inducidas por el cáncer (Greenlee et al., 2000) . Existen excelentes opciones curativas para fases localmente limitadas, a saber cirugía (Huland, 2001a) y/o terapia de radiación (Wiegel, 1998) , mientras que en el caso de fases avanzadas se pueden utilizar métodos de ablación hormonal, meramente eficaces temporalmente. Al

progreso que se produce recientemente de la enfermedad inicial durante la terapia de ablación hormonal, habitualmente al cabo de 2-3 años, se le alude como estado homono-refractario. Actualmente existen sólo opciones de terapia paliativa para el carcinoma de próstata hormono-refractario (Knox y Moore, 2001) .

Por consiguiente, es de importancia crucial diagnosticar el carcinoma de próstata en una fase temprana. Con PSA,

el antígeno prostático específico, está disponible un marcador tumoral en suero altamente sensible para el diagnóstico inicial (Stamey et al., 1987) y la acción posterior (Haese et al., 1999) del carcinoma de próstata.

Dado que el PSA es, en gran medida, específico para el órgano, pero no específico para tumores, la enfermedad benigna de la próstata puede asociarse también con un aumento de PSA que excede el intervalo de 4 ng/ml, 25 considerado como límite superior. La producción posterior invasiva de al menos 10 biopsias por sacabocado de próstata obtenidas de modo transrectal representa actualmente el patrón de oro en el diagnóstico definitivo de carcinoma de próstata en esta situación (Miller y Weiβbach, 1999a, b) . Sin embargo, hasta el 25% de los pacientes que padecen complejidades relevantes hacen necesaria una consulta adicional (13% de los pacientes) y una hospitalización (aproximadamente 6% de los pacientes afectados) (Lujan et al., 2001; Djavan et al., 2001) . Aparte 30 del riesgo de una infección del tracto urinario o el riesgo de la prostatitis, predominan una hemorragia y el dolor de la operación como incidencias indeseadas adicionales, las cuales son contrarrestadas en algunas pocas instituciones solamente llevando a cabo medidas de anestesia local (Irani et al., 1997; Issa et al., 2000; Alavi et al., 2001) . Una biopsia por sacabocado, llevada a cabo en el caso de aproximadamente el 75% de los pacientes con valores de PSA en el intervalo entre 4-10 ng/ml mostrará hallazgos diagnósticos negativos, es decir, benignos (Huland, 2001b) . Si la indicación para llevar a cabo biopsias por sacabocado de próstata se derivó ya de valores de PSA que partían de 2, 5 ng/ml, tal como se sugiere actualmente por algunos autores (Djavan et al., 1999; Okihara et al., 2001) , sería de esperar que este método invasivo de examen físico lo padecieran cada cuarto hombre de edades comprendidas entre 50 y 75 años (Huland, 2001b) .

Por lo tanto, son de elevado interés para el diagnóstico de carcinoma de próstata nuevos marcadores con una especificidad potenciada frente a PSA, incluidas sus sub-formas (Jung et al., 2001; Makinen et al., 2001) , ya que éstos podrían definir mejor las indicaciones para llevar a cabo biopsias por sacabocado invasivas y, así, podrían reducir el número de pacientes que se vieran sometidos a este examen. Un marcador de tumores adecuado también para material de sonda, obtenido de forma no invasiva tal como plasma u orina exprimida con un 45 espectacular especificidad, podría así ser el marcador de anexina A3 (ANXA3) recientemente caracterizado (Wozny et al., 2006) .

ANXA3 es un representante más bien raro de la familia de anexinas, una clase de proteínas efectoras de Ca2+ que llevan a cabo sus efectos versátiles uniéndose a fosfolípidos particulares. Pueden formar redes sobre la superficie 50 de la membrana y, así, organizan microdominios de la membrana y reclutan focos para proteínas interactuantes (Gerke et al., 2005) .

Con ello, las anexinas juegan importantes papeles en la diferenciación celular, la migración de células y también en la inmunomodulación. Aparte de la estructura de la membrana y del transporte de la membrana, existen 55 también interacciones proteína-proteína independientes de la membrana y de fosfolípidos de las anexinas (Rescher y Gerke 2004; Gerke y Moss, 2002) . Las anexinas participan como componentes principales de vesículas de la matriz en la formación del cartílago y la mineralización de los huesos (Wang et al., 2003) . La expresión diferencial de ANXA3 es particularmente interesante con respecto a la frecuencia inusual de la aparición de metástasis en los huesos osteoblásticas en el caso del carcinoma de próstata (Keller et al., 2001) .

ANXA3 se produce de modo intracelular así como extracelular (Carlson et al., 2004) , por ejemplo en exosomas en la orina (Pisitkun et al., 2004) . Los exosomas son derivados de los denominados “cuerpos multivesiculares” y

pueden jugar un papel alternativo, pero decisivo en la presentación de antígenos de células inmunes (Schartz et al., 2002) . Los exosomas detectados en la orina son posiblemente idénticos a los denominados prostasomas descritos ya en una fecha anterior (Arienti et al., 2004; Utleg et al., 2003) , en cualquier caso, ambos contienen ANXA3.

Biomarcadores de proteínas para la terapia o el diagnóstico de cáncer de próstata y otros cánceres epiteliales del tracto urogenital se describe en los documentos US 2005 130 876, WO 03 086 461, WO 2005 078 124, EP 05 011

042.8 y EP 05 026 092.6.

El documento WO 2005/078124 describe el uso de proteína ANXA3 como marcador diagnóstico para el cáncer de 15 próstata. Además de ello, el documento WO 2005/078124 describe el uso de antagonistas o agonistas para el tratamiento de cáncer de próstata. El antagonista o agonista puede ser un anticuerpo.

El documento WO 03/009814 describe marcadores para el cáncer de próstata, entre ellos también se menciona a ANXA3.

Diakonova et al. (Journal of Cell Science 1997, 110:1199-1213) describe la localización de anexinas en macrófagos y fagosomas. Con ello, se utiliza un antisuero que es monoespecífico para ANXA3.

Le Cabec et al. (1992, 189 (3) :1471-1476) describe la expresión diferencial de dos formas de ANXA3 en neutrófilos 25 y monocitos humanos detectados mediante un suero inmune dirigido contra ANXA3.

Sin embargo, métodos previos para la determinación de ANXA3 adolecen de la baja especificidad de anticuerpos disponibles que muestran una reactividad cruzada considerable hacia otras anexinas. Así, el objeto de la presente invención era proporcionar un método para determinar carcinoma de próstata que permitiera un diagnóstico muy

específico en una fase temprana de la enfermedad.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método in vitro para el diagnóstico de cáncer de próstata, en el que se analiza una muestra en cuanto a la presencia y/o cantidad de anexina A3 que, esencialmente, no tiene ninguna reactividad cruzada contra otras anexinas, en donde el anticuerpo se produce por

la línea de células de hibridoma tgc 7 ProVII5C5 o un anticuerpo que se une al mismo epítopo sobre anexina A3.

La línea de células de hibridoma tgc 7 ProVII5C5 ha sido depositada el 5 de mayo de 2006 con el número de acceso DSM ACC2780 en la DSMZ, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, de acuerdo con el Tratado de Budapest.

Otro aspecto es un anticuerpo específico para anexina A3 que no tiene esencialmente reactividad cruzada alguna contra otras anexinas, en donde el anticuerpo se produce por la línea de células de hibridoma tgc 7 ProVII5C5 (DSM ACC2780) o un anticuerpo que se une al mismo epítopo sobre anexina A3.

Un aspecto adicional de la presente invención es un reactivo de ensayo para el diagnóstico del cáncer que comprende al menos un anticuerpo de la presente invención, específico para anexina A3, que tiene una baja reactividad cruzada contra otras anexinas.

Todavía un aspecto adicional de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende, en 50 calidad de agente activo, un anticuerpo de la presente invención, específico para anexina A3 que tiene una baja reactividad cruzada... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para el diagnóstico de cáncer de próstata, en el que una muestra se analiza en cuanto a la presencia y/o cantidad de anexina A3 con un anticuerpo específico para anexina A3 que no tiene esencialmente 5 reactividad cruzada alguna contra otras anexinas, en el que el anticuerpo se produce por la línea de células de hibridoma tgc 7 ProVII5C5, DSM ACC2780, o un anticuerpo que se une al mismo epítopo sobre anexina A3.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, particularmente un anticuerpo monoclonal quimérico o humanizado o humano.

1.

3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el anticuerpo está dirigido contra el extremo N de anexina A3.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el anticuerpo está dirigido contra un epítopo 15 en la región de los aminoácidos 1-106 de anexina A3 humana.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el anticuerpo está dirigido contra un epítopo sobre la anexina A3 que comprende la secuencia VRDYPDFSPSVD (SEQ ID NO: 1) o una secuencia contigua parcial de la misma con una longitud de al menos 6 aminoácidos.

2.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que se determina la presencia y/o cantidad de anexina A3 extracelular y/o la presencia y/o cantidad de anexina A3 intracelular.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el diagnóstico incluye una determinación de 25 la fase de la enfermedad, preferiblemente en donde al menos se lleva a cabo una diferenciación entre una fase precancerosa y una fase cancerosa.

8. Uso de un reactivo de ensayo para el diagnóstico in vitro de cáncer de próstata, comprendiendo dicho reactivo de ensayo al menos un anticuerpo específico para anexina A3 que no tiene esencialmente reactividad cruzada 30 alguna contra otras anexinas, en el que el anticuerpo es como se define en las reivindicaciones 1-5.

9. Uso de un anticuerpo específico para anexina A3 que no tiene esencialmente reactividad cruzada alguna contra otras anexinas para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer de próstata, en donde el anticuerpo es como se define en las reivindicaciones 1-5.

3.

10. Una composición farmacéutica que comprende, en calidad de agente activo, un anticuerpo específico para anexina A3 que no tiene esencialmente reactividad cruzada alguna contra otras anexinas, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer de próstata, en donde el anticuerpo es como se define en las reivindicaciones 1-5.

4.

11. Uso de un anticuerpo específico para anexina A3 para el diagnóstico in vitro de cáncer de próstata, no teniendo dicho anticuerpo esencialmente reactividad cruzada alguna contra otras anexinas, en donde el anticuerpo es como se define en las reivindicaciones 1-5.

12. Uso de una célula capaz de producir un anticuerpo específico para anexina A3 en un método para producir un anticuerpo para el diagnóstico de cáncer de próstata, en donde el anticuerpo es específico para anexina A3 y no tiene esencialmente reactividad cruzada alguna contra otras anexinas, en donde el anticuerpo es como se define en las reivindicaciones 1-5.

13. Un anticuerpo específico para anexina A3 que no tiene esencialmente reactividad cruzada alguna contra otras anexinas, en donde el anticuerpo se produce por la línea de células de hibridoma tgc7 ProVII5C5, DSM ACC2780,

o un anticuerpo que se une al mismo epítopo sobre anexina A3.

14. El anticuerpo de la reivindicación 13, que es un anticuerpo monoclonal, particularmente un anticuerpo 55 monoclonal quimérico o humanizado o humano.

15. El anticuerpo de la reivindicación 13 ó 14, dirigido contra el extremo N de anexina A3.

16. El anticuerpo de la reivindicación 13 ó 14, dirigido contra un epítopo en la región de los aminoácidos 1-106 de anexina A3 humana.

17. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 13-16, dirigido contra un epítopo de anexina A3, que comprende la secuencia VRDYPDFSPSVD (SEQ ID NO: 1) o una secuencia contigua parcial de la misma con una longitud de al menos 6 aminoácidos.