Anticuerpos de unión inmunosupresores y procedimientos para la obtención y la utilización de los mismos.

Un anticuerpo aislado que se une específicamente al agente inmunosupresor tacrolimus,

donde dicho anticuerpo tiene un dominio pesado variable y un dominio ligero variable, comprendiendo el dominio pesado variable una región determinante de complementariedad ("CDR") 1 de cadena pesada, una CDR 2 de cadena pesada y una CDR 3 de cadena pesada, comprendiendo el dominio ligero variable una CDR 1 de cadena ligera, una CDR 2 de cadena ligera y una CDR 3 de cadena ligera, donde

(a) la CDR 1 de la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos de: Gly - Phe - Thr - Phe - Ser - Ser - Tyr - Gly - Met - Ser (SEC ID Nº: 2);

(b) la CDR 2 de la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos con una fórmula de:

Thr - Ile - Ser - Ser - Gly - Gly - Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Phe (SEC ID Nº: 33) donde Xaa1 se elige de entre el grupo que consiste en treonina (Thr), alanina (Ala), lisina (Lys) y ácido glutámico (Glu); donde Xaa2 se elige de entre el grupo que consiste en tirosina (Tyr) y triptófano (Trp); y

donde Xaa3 se elige de entre el grupo que consiste en treonina (Thr) y valina (Val);

(c) la CDR 3 de la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos de: Gln - Thr - Asp - Gly - Tyr - Ser - Trp - Phe - Pro - Tyr (SEC ID Nº: 6);

(d) la CDR 1 de la cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos con una fórmula de:

Lys - Ser - Ser - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Val - His - Ser - Thr - Gly - Asn - Thr - Phe - Leu - Glu (SEC ID Nº: 34) donde Xaa4 se elige de entre el grupo que consiste en: glutamina (Gln), alanina (Ala) y glicina (Gly); donde Xaa5 se elige de entre el grupo que consiste en: serina (Ser) y glicina (Gly); y donde Xaa6 se elige de entre el grupo que consiste en: isoleucina (Ile) y leucina (Leu);

(e) la CDR 2 de la cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos con una fórmula de:

Lys - Ile - Ser - Asn - Arg - Phe - Ser (SEC ID Nº: 11); y

(f) la CDR 3 de la cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos con una fórmula de:

Phe - Gln - Gly - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Pro - Leu - Thr (SEC ID Nº: 35), donde Xaa7 se elige de entre el grupo que consiste en: Serina (Ser) y Glicina (Gly); donde Xaa8 se elige de entre el grupo que consiste en: histidina (His), arginina (Arg), valina (Val), treonina (Thr), lisina (Lys) y serina (Ser); y donde Xaa9 se elige de entre el grupo que consiste en: valina (Val), alanina (Ala), ácido aspártico (Asp), cisteína (Cys) y Serina (Ser); con la condición de que si la CDR 2 de la cadena pesada Xaa1 es Thr, Xaa2 es Tyr y Xaa3 es Thr y en la CDR 1 de la cadena ligera Xaa4 es Gln, Xaa5 es Ser y Xaa6 es Ile, entonces en la CDR 3 de la cadena ligera Xaa9 es distinto a Val si Xaa7 es Ser y Xaa8 es His, o Xaa8 es distinto a His si Xaa7 es Ser y Xaa9 es Val o Xaa7 es distinto a Ser si Xaa8 es His y Xaa9 es Val;

donde el anticuerpo tiene una KD de entre 1,89 x 10-11 M y 1,0 x 10-13 M cuando el anticuerpo no ha sido expuesto a, ni incubado con, al menos un diluyente de selección, y una KD de entre 1,51 x 10-10 M y 1,0 x 10-12 M cuando el anticuerpo se expone a, se incuba con, o está en presencia de, al menos un diluyente de selección.

Anticuerpos de unión inmunosupresores y procedimientos para la obtención y la utilización de los mismos

Campo de la invención Entre otras cosas, la presente invención se refiere a anticuerpos aislados que se unen inmunoespecíficamente con una elevada afinidad de unión al agente inmunosupresor tacrolimus. La presente invención también se refiere a un inmunoensayo diagnóstico in vitro para el tacrolimus, en el que dicho inmunoensayo comprende un anticuerpo de la presente invención.

Antecedentes de la invención El tacrolimus, también conocido como FK506, es el nombre genérico del macrólido inmunosupresor producido por la bacteria Streptomyces tsukabaensis, en el suelo (véase, Inamura, N., y col., Transplantation, 45 (1) : 206 -209 (1988) ) . La primera generación principal de metabolitos del tacrolimus son tacrolimus 13-O-desmetilados ("M-1") , tacrolimus 31-O-desmetilados ("M-II") , y tacrolimus 15-O-desmetilados ("M-III") . El tacrolimus se ha usado por vía intravenosa y oral para la prevención del rechazo de órganos, particularmente en pacientes que reciben un transplante de hígado, de riñón o de médula ósea.

La ciclosporina ("CsA") es un fármaco inmunosupresor obtenido a partir de ciertos hongos del suelo. Aunque principalmente se usa para prevenir el rechazo de órganos después del trasplante, la CsA también se ha usado para tratar otras enfermedades, tales como la anemia aplásica, o para prevenir la enfermedad del injerto frente al hospedador (GVHD) .

El tacrolimus tiene una potencia in vivo 50 -100 veces mayor que la ciclosporina CsA (véase, Murthy, J. N., y col., Clinical Biochemistr y , 31 (8) : 613 - 617 (1998) ) . El efecto inmunosupresor del tacrolimus es similar al de la CsA y se cree que es a través de la inhibición selectiva de la producción de linfocitos T citotóxicos. Id. A nivel molecular, parece que el tacrolimus bloquea selectivamente las actividades transcripcionales tempranas en la respuesta de los linfocitos T. Id. Esta acción del tacrolimus se atribuye a la unión del fármaco a unas proteínas citosólicas específicas denominadas inmunofilinas para formar un complejo. Id. este complejo interactúa con una calcineurina dependiente de calcio-vías de translocación de calmodulina, e inhibe la translocación nuclear de un factor transcripcional ("NF-AT") , que se une a una secuencia de polinucleótidos promotora de los genes de la IL-2, necesarios para la transcripción del ARNm de la IL-2.

Clínicamente, se sabe que el tacrolimus reduce los episodios de rechazo en los pacientes trasplantados. Aunque es terapéuticamente beneficioso, el tacrolimus muestra una cierta toxicidad similar a la de la CsA, que incluye nefrotoxicidad, complicaciones del tracto gastrointestinal y neurotoxicidad. Id. Al contrario que la CsA, el tacrolimus no provoca hirsutismo ni hipercolesterolemia. Id. En vista de los problemas de toxicidad relacionados con el tacrolimus, se usan inmunoensayos para monitorizar las concentraciones sanguíneas de tacrolimus en pacientes que reciben tratamiento con este fármaco.

En el mercado hay disponible una variedad de diferentes inmunoensayos diagnósticos para monitorizar las concentraciones sanguíneas de tacrolimus. Muchos de estos inmunoensayos usan disolventes orgánicos para extraer el tacrolimus de las muestras de sangre completa. El disolvente orgánico aumenta la constante de disociación en equilibrio (KD) y/o disminuye la actividad funcional del anticuerpo usado en los ensayos. La reducida actividad del anticuerpo conduce a una menor sensibilidad del ensayo y potencialmente reduce la precisión y la robustez. Se han realizado intentos de aumentar la sensibilidad del ensayo reduciendo la cantidad de disolvente orgánico usada durante el proceso de extracción. Sin embargo, se encontró que la reducción en la cantidad de disolvente afectaba a la eficacia de extracción, y por lo tanto, a la reproducibilidad del ensayo.

De forma análoga, en el mercado hay disponible una variedad de diferentes inmunoensayos diagnósticos para monitorizar las concentraciones sanguíneas de CsA, por ejemplo, utilizando un anticuerpo anti-ciclosporina. La bibliografía actual sugiere que la generación de metabolitos de la CsA puede enmascarar la concentración del fármaco parental activo (CsA) . La dosis apropiada del inmunosupresor CsA es crítica para los pacientes con trasplantes de órganos.

El artículo de Takamura K. y col. ("A Highly Sensitive method to Assay FK-506 Levels in Plasma", Transplantation Proceedings, 1 de octubre de 1987 - 19: 23 - 29) desvela anticuerpos anti-tracolimus 1-60-46 y un anticuerpo policlonal con una mayor sensibilidad que el anticuerpo 1-60-46.

Por lo tanto, hay una necesidad en la técnica de nuevos anticuerpos que tengan unas características de unión mejoradas (tales como afinidad y especificidad) que puedan ser usados en dichos inmunoensayos diagnósticos in vitro.

Resumen de la invención En un aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo aislado que se une específicamente al agente inmunosupresor tacrolimus, donde dicho anticuerpo tiene un dominio pesado variable y un dominio ligero variable, comprendiendo el dominio pesado variable una región determinante de la complementariedad de la cadena pesada ("CDR") 1, una CDR 2 de la cadena pesada y una CDR 3 de la cadena pesada, comprendiendo el dominio de cadena ligera variable una CDR 1 de la cadena ligera, una CDR 2 de la cadena ligera y una CDR 3 de la cadena ligera, donde

(a) la CDR 1 de la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos de: Gly - Phe - Thr - Phe - Ser - Ser -Tyr - Gly - Met - Ser (SEC ID Nº: 2) ;

(b) la CDR 2 de la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos con una fórmula de: Thr - Ile- Ser -Ser - Gly- Gly- Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Phe (SEC ID Nº: 33)

donde Xaa1 se elige de entre el grupo que consiste en treonina (Thr) , alanina (Ala) , lisina (Lys) y ácido glutámico (Glu) ; donde Xaa2 se elige de entre el grupo que consiste en tirosina (Tyr) y triptófano (Trp) ; y donde Xaa3 se elige de entre el grupo que consiste en treonina (Thr) y valina (Val) ;

(c) la CDR 3 de la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos con una fórmula de: Gln - Thr - Asp -Gly - Tyr - Ser - Trp - Phe - Pro - Tyr (SEC ID Nº: 6) ;

(d) la CDR 1 de la cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos con una fórmula de:

Lys - Ser - Ser - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Val - His - Ser - Thr - Gly - Asn - Thr - Phe - Leu - Glu (SEC ID Nº: 34)

donde Xaa4 se elige de entre el grupo que consiste en: glutamina (Gln) , alanina (Ala) y glicina (Gly) ;

donde Xaa5 se elige de entre el grupo que consiste en: serine (Ser) y glicina (Gly) ; y

donde Xaa6 se elige de entre el grupo que consiste en: isoleucina (Ile) y leucina (Leu) ;

(e) la CDR 2 de la cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos con una fórmula de:

Lys- Ile- Ser - Asn- Arg- Phe- Ser (SEC ID Nº:11)

(f) la CDR 3 de la cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos con una fórmula de:

Phe- Gln - Gly- Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Pro - Leu - Thr (SEC ID Nº: 35) ,

donde Xaa7 se elige de entre el grupo que consiste en: Serina (Ser) y Glicina (Gly) ; donde Xaa8 se elige de entre el grupo que consiste en: histidina (His) , arginina (Arg) , valina (Val) , treonina (Thr) , lisina (Lys) y serina (Ser) ; y donde Xaa9 se elige de entre el grupo que consiste en: valina (Val) , alanina (Ala) , ácido aspártico (Asp) , cisteína (Cys) y Serina (Ser) ; con la condición de que si en la CDR 2 de la cadena pesada Xaa1 es Thr, Xaa2 es Tyr y Xaa3 es Thr y en la CDR 1 de la cadena ligera Xaa4 es Gln, Xaa5 es Ser y Xaa6 es Ile, entonces en la CDR 3 de la cadena ligera Xaa9 es distinto a Val si Xaa7 es Ser y Xaa8 es His, o Xaa8 es distinto a His si Xaa7 es Ser y Xaa9 es Val o Xaa7 es distinto a Ser si Xaa8 es His y Xaa9 es Val; donde el anticuerpo tiene una KD de entre 1, 89 x 10-11 M y 1, 0 x 10-13 M cuando el anticuerpo no ha sido expuestos ni se ha incubado con al menos un diluyente de selección, y una KD de entre 1, 51 x 10-10 y 1, 0 x 10-12 M cuando el anticuerpo se ha expuesto a, o incubado con, o está en presencia de, al menos un diluyente de selección.

El al menos un diluyente de selección puede comprender un tampón, una sal, un detergente, un competidor de unión, un disolvente o combinaciones de los mismos. El tampón puede ser MES, MOPS, HEPES, TRIS, fosfato, citrato o borato. La sal puede ser NaCl, KCl o sulfato de cinc. El detergente puede ser un detergente aniónico, un detergente catiónico, un detergente no iónico o un detergente anfótero. El competidor de unión puede ser un hapteno metabolito, una hormona, un fármaco, una enzima, un receptor, una proteína, un péptido, un polipéptido,... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo aislado que se une específicamente al agente inmunosupresor tacrolimus, donde dicho anticuerpo tiene un dominio pesado variable y un dominio ligero variable, comprendiendo el dominio pesado variable una región determinante de complementariedad ("CDR") 1 de cadena pesada, una CDR 2 de cadena pesada y una CDR 3 de cadena pesada, comprendiendo el dominio ligero variable una CDR 1 de cadena ligera, una CDR 2 de cadena ligera y una CDR 3 de cadena ligera, donde

(a) la CDR 1 de la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos de: Gly - Phe - Thr - Phe - Ser - Ser -Tyr - Gly - Met - Ser (SEC ID Nº: 2) ;

(b) la CDR 2 de la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos con una fórmula de:

Thr - Ile - Ser - Ser - Gly - Gly - Xaa1 - Xaa2 -Xaa3 - Phe (SEC ID Nº: 33) donde Xaa1 se elige de entre el grupo que consiste en treonina (Thr) , alanina (Ala) , lisina (Lys) y ácido glutámico (Glu) ; donde Xaa2 se elige de entre el grupo que consiste en tirosina (Tyr) y triptófano (Trp) ; y

donde Xaa3 se elige de entre el grupo que consiste en treonina (Thr) y valina (Val) ;

(c) la CDR 3 de la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos de: Gln - Thr - Asp - Gly - Tyr - Ser -Trp - Phe - Pro - Tyr (SEC ID Nº: 6) ;

(d) la CDR 1 de la cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos con una fórmula de:

Lys - Ser - Ser - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Val - His - Ser - Thr - Gly - Asn - Thr - Phe - Leu - Glu (SEC ID Nº: 34) donde Xaa4 se elige de entre el grupo que consiste en: glutamina (Gln) , alanina (Ala) y glicina (Gly) ; donde Xaa5 se elige de entre el grupo que consiste en: serina (Ser) y glicina (Gly) ; y donde Xaa6 se elige de entre el grupo que consiste en: isoleucina (Ile) y leucina (Leu) ;

(e) la CDR 2 de la cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos con una fórmula de:

Lys - Ile - Ser - Asn -Arg - Phe - Ser (SECIDNº: 11) ; y

(f) la CDR 3 de la cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos con una fórmula de:

Phe - Gln - Gly - Xaa7 -Xaa8 -Xaa9 - Pro - Leu - Thr (SEC ID Nº: 35) , donde Xaa7 se elige de entre el grupo que consiste en: Serina (Ser) y Glicina (Gly) ; donde Xaa8 se elige de entre el grupo que consiste en: histidina (His) , arginina (Arg) , valina (Val) , treonina (Thr) , lisina (Lys) y serina (Ser) ; y donde Xaa9 se elige de entre el grupo que consiste en: valina (Val) , alanina (Ala) , ácido aspártico (Asp) , cisteína (Cys) y Serina (Ser) ; con la condición de que si la CDR 2 de la cadena pesada Xaa1 es Thr, Xaa2 es Tyr y Xaa3 es Thr y en la CDR 1 de la cadena ligera Xaa4 es Gln, Xaa5 es Ser y Xaa6 es Ile, entonces en la CDR 3 de la cadena ligera Xaa9 es distinto a Val si Xaa7 es Ser y Xaa8 es His, o Xaa8 es distinto a His si Xaa7 es Ser y Xaa9 es Val o Xaa7 es distinto a Ser si Xaa8 es His y Xaa9 es Val; donde el anticuerpo tiene una KD de entre 1, 89 x 10-11 M y 1, 0 x 10-13 M cuando el anticuerpo no ha sido expuesto a, ni incubado con, al menos un diluyente de selección, y una KD de entre 1, 51 x 10-10 M y 1, 0 x 10-12 M cuando el anticuerpo se expone a, se incuba con, o está en presencia de, al menos un diluyente de selección.

2. Una línea celular de ovario de hámster chino elegida de entre el grupo que consiste en tacrolimus 1-60-46 AM2 CHO 2-577 con el número de acceso de la A.T.C.C. PTA-7436 y tacrolimus 1-60-46 AM2 CHO 1-1157 con el número de acceso de la A.T.C.C. PTA-7446.

3. Un anticuerpo elaborado partir del ADN extraído de una línea celular de ovario de hámster chino elegida de entre el grupo que consiste en tacrolimus 1-60-46 AM2 CHO 2-577 con el número de acceso de la A.T.C.C. PTA-7436 y tacrolimus 1-60-46 AM2 CHO 1-1157 con el número de acceso de la A.T.C.C. PTA-7446.

4. Un anticuerpo o un fragmento de unión a tacrolimus del mismo producido mediante una línea celular de ovario de hámster chino elegida de entre el grupo que consiste en tacrolimus 1-60-46 AM2 CHO 2-577 con el número de acceso de la A.T.C.C. PTA-7436 y tacrolimus 1-60-46 AM2 CHO 1-1157 con el número de acceso de la A.T.C.C. PTA-7446.

5. Un inmunoensayo diagnóstico in vitro para tacrolimus, donde dicho inmunoensayo comprende un anticuerpo de la reivindicación 1, 3 ó 4.

6. El inmunoensayo de la reivindicación 5, donde dicho inmunoensayo comprende un anticuerpo individual que se une específicamente al tacrolimus.

7. El inmunoensayo de la reivindicación 5, donde dicho inmunoensayo comprende adicionalmente un compañero de unión específico para el tacrolimus.