Anticuerpos anti-CD28 superagonistas.

Ácido nucleico, que codifica una molécula de unión, que se une específicamente a una molécula CD28 humana,

que comprende

a) una secuencia de ácido nucleico que codifica una región VH y una secuencia de ácido nucleico quecodifica una región VL, que comprenden unas CDRs en un armazón de inmunoglobulina humana,realizándose que

i) la secuencia de ácido nucleico de la región VH comprende la SEQ ID No.: 33 y/o codifica un(poli)péptido, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No.: 34; y

ii) la secuencia de ácido nucleico de la región VL comprende la SEQ ID No.: 35 y/o codifica un(poli)péptido, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No.: 36y

b) una secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante de un anticuerpo IgG1 o IgG4 humano.

Anticuerpos anti-CD28 superagonistas El invento se refiere a un ácido nucleico que codifica una molécula de unión, que se une específicamente a una molécula CD28 humana, que comprende

(a) una secuencia de ácido nucleico que codifica una región VH y una secuencia de ácido nucleico que codifica una región VL, que comprenden unas CDRs en un armazón de inmunoglobulina humana y

(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de un anticuerpo IgG1 o IgG4 humano.

La estimulación de los linfocitos T en reposo para la activación, la proliferación y la diferenciación funcional requiere la ocupación de dos estructuras superficiales, a saber los denominados receptores: 1. del receptor de antígenos, que posee una especificidad diferente de una célula a otra, y es necesario para el reconocimiento de unos antígenos, p.ej. de productos víricos de disociación; así como 2. de la molécula CD28 expresada de igual manera en todas las células T en reposo con la excepción de un subconjunto de las células T de CD8 de seres humanos, que se une de un modo natural a unos ligandos situados sobre la superficie de otras células del sistema inmunitario, . Se habla de la estimulación concomitante de la reacción inmunológica específica para antígenos por medio de la CD28. En un cultivo de células se pueden recrear estos procesos mediante la ocupación del receptor de antígenos así como de la molécula CD28 con unos adecuados anticuerpos monoclonales (mAb’s) . En el sistema clásico de la estimulación concomitante, ni la ocupación del receptor de antígenos ni la de la molécula CD28 a solas dan lugar a la proliferación de las células T, pero la ocupación de los dos receptores es no obstante eficaz. Esta observación se realizó en células T de un ser humano, de un ratón y de una rata.

No obstante, se conocen también unos mAb's específicos para la CD28, que pueden inducir la proliferación de las células T sin ninguna estimulación concomitante. Una tal activación superagonista, es decir independiente de la ocupación del receptor de antígenos, de los linfocitos T en reposo mediante unos mAb's específicos para la CD28, es conocida a partir de la cita bibliográfica de Tacke y colaboradores, Eur. J. Immunol., 1997, 27:239-247. Según esto, se describieron dos tipos de anticuerpos monoclonales específicos para la CD28 con diferentes propiedades funcionales: unos mAb's concomitantemente estimuladores, que estimulan concomitantemente la activación de células T en reposo solamente en el caso de una simultánea ocupación del receptor de antígenos; y unos mAb's superagonistas, que pueden activar la proliferación de linfocitos T de todas las clases in vitro y en ratas sin ninguna ocupación del receptor de antígenos.

A partir del documento de patente alemana DE 101 60 516.1 así como de la cita bibliográfica de Lühder y colaboradores, J. Exp. Med., 2003, 197: 955-966, se conocen asimismo unos mAb's superagonistas con una especificidad para la molécula CD28 de seres humanos, que activan y expanden muy eficazmente a los linfocitos T in vitro sin ninguna estimulación del receptor de antígenos de las células T (TCR) . Aquí se hizo uso, sin embargo, unos anticuerpos inmovilizados, que, tal como se ilustra más abajo, no son apropiados para usos terapéuticos.

Por lo demás, los anticuerpos anti-CD28 superagonistas mostraron, en modelos de animales y en cultivos de células, unas pronunciadas propiedades anti-inflamatorias. Así, por ejemplo, tal como se explica en la cita de Schmidt y colaboradores, J. Neuroimmunol., 2003, 140: 143-152, la utilización de un mAb superagonista dirigido contra la molécula CD28 de una rata puede evitar la formación de una enfermedad neurológica periférica inflamatoria, la neuritis autoimmunológica experimental, EAN. A partir del documento DE 102 12 108.7 así como de la cita de Lin y colaboradores, Eur. J. Immunol., 2003, 33:626-638, se conoce que unos anticuerpos anti-CD28 superagonistas pueden dar lugar a una fuerte activación, superior a la proporcional, de las células T reguladoras. La función de las células T reguladoras consiste en controlar a las células T autoagresivas y procurar que, de un modo general, no se llegue a ninguna reacción inflamatoria excesiva (Schwartz, Nature Immunol., 2005, 6: 327-330) No obstante, una intervención en la estimulación concomitante mediada por la CD28 puede desplazar el equilibrio entre Th1 y Th2 en favor del fenotipo Th1 pro-inflamatorio y alberga por lo tanto el peligro de empeorar unas reacciones autoinmunológicas o inflamatorias (véase más arriba la cita de Schmidt y colaboradores) .

Para los candidatos a constituir unos anticuerpos terapéuticos es digno de pretenderse, por motivos evidentes, evitar la inmunogenicidad, es decir la provocación de una respuesta inmunitaria contra la sustancia activa, con la meta de aprovechar totalmente la eficacia farmacológica en seres humanos, y simultáneamente reducir unos efectos secundarios indeseados. Con el fin de evitar la inmunogenicidad de unos anticuerpos, que no proceden de seres humanos, constituye un estado de la técnica, por ejemplo, la "humanización" de anticuerpos por medio de unos métodos de tecnología genética. En este contexto, se conserva el sitio de unión con antígenos de un anticuerpo que originalmente no procede de seres humanos, mientras que el resto de la molécula de anticuerpo, en particular las porciones constantes del anticuerpo (el dominio constante o el fragmento Fc) se intercambian por una variante estructuralmente similar que procede del material genético humano (Hwang y colaboradores, Methods, 2005, 36:

3. 10) .

Tal como se conoce a partir del documento DE 102 30 223.5, la reticulación transversal (o reticulación cruzada, en inglés "cross-linking") de unos anticuerpos anti CD28 humana superagonistas refuerza su capacidad de activar a los linfocitos T en una suspensión de células. Por ejemplo, la proliferación de unos linfocitos T purificados es reforzada en un valor múltiplo, cuando se utilizan unos anticuerpos superagonistas en forma de unos complejos moleculares inmovilizados sobre unas bolitas paramagnéticas, en lugar de presentarse en una forma soluble en la suspensión de células T. Para el uso galénico en seres humanos, la aplicación de unas formas de presentación, convertidas en complejos de tal manera, de unos anticuerpos anti CD28 superagonistas no es posible por motivos evidentes. Por lo demás, en el documento DE 102 30 223.5 unos anticuerpos anti IgG de ratón inmovilizados sobre bolitas paramagnéticas pasaron a emplearse como un agente reticulador cruzado. También desde este punto de vista, no entra en cuestión el enfoque análogo para un uso terapéutico en seres humanos, puesto que se prohíbe la utilización de unos anticuerpos anti-IgG humana por causa de la gran cantidad de reacciones cruzadas que se deben de esperar. No en último término, el enfoque descrito en el documento DE 102 30 223.5 está restringido a un procedimiento in vitro, en cuyo caso pasan a emplearse unas células T purificadas. Para el desarrollo de unos anticuerpos anti-CD28 superagonistas terapéuticos se debería comprobar por consiguiente, si existe un adecuado formato de anticuerpo, que haga posible in vivo una reticulación cruzada suficiente, sin conseguir efectos indeseados de ningún tipo.

Es conocido el hecho de que un reconocimiento natural y una reticulación transversal o cruzada de unos dominios Fc de anticuerpos es mediada en el cuerpo humano por unos receptores Fc, que son expresados en diferentes tipos de células (Woof y colaboradores, Nature Reviews Immunol., 2004, 1-11) . El objetivo de la unión con anticuerpos, mediada por el receptor Fc en el contexto fisiológico es “retirar de la circulación” o destruir a unas células cargadas con anticuerpos, puesto que se ha de partir del hecho de que los anticuerpos son formados solamente contra las células que proceden de un tejido ajeno, están infectadas por bacterias o virus, estresadas o degenerado malígnamente. Unos importantes mecanismos, mediados por receptores Fc para la eliminación de unas células cargadas con anticuerpos, son la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC acrónimo de Complement Dependent Cytotoxicity) , la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC acrónimo de Antibody Dependent Cell Cytotoxicity) y la opsonización, es decir la caracterización para la fagocitosis por medio de unos macrófagos especializados.

Los receptores Fc, que son responsables del reconocimiento de unos dominios Fc de anticuerpos humanos del isotipo IgG, se pueden clasificar en los conjuntos de CD64 (el receptor Fc gamma I; un receptor altamente afín) ; CD32 (el receptor Fc gamma II; un receptor de afinidad intermedia)... [Seguir leyendo]

1. Ácido nucleico, que codifica una molécula de unión, que se une específicamente a una molécula CD28 humana, que comprende a) una secuencia de ácido nucleico que codifica una región VH y una secuencia de ácido nucleico que codifica una región VL, que comprenden unas CDRs en un armazón de inmunoglobulina humana, realizándose que i) la secuencia de ácido nucleico de la región VH comprende la SEQ ID No.: 33 y/o codifica un (poli) péptido, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No.: 34; y ii) la secuencia de ácido nucleico de la región VL comprende la SEQ ID No.: 35 y/o codifica un (poli) péptido, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No.: 36

y

b) una secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante de un anticuerpo IgG1 o IgG4 humano.

2. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia de ácido nucleico, realizándose que la secuencia de ácido nucleico i) es la SEQ ID No.: 13, 29, 41 o 45; y/o ii) codifica un (poli) péptido con la secuencia de aminoácidos SEQ ID No.: 14, 30, 42 o 46.

3. Ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende una secuencia de ácido nucleico, realizándose que la secuencia de ácido nucleico i) es la SEQ ID No.: 15 o 43; y/o ii) codifica un (poli) péptido con la secuencia de aminoácidos SEQ ID No.: 16 o 44.

4. Ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 3, que comprende además de ello una 30 secuencia de ácido nucleico que codifica un elemento marcador o una marca (Tag) .

5. Vector, que comprende el ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 4, o un anfitrión no humano, transformado o transfectado con un tal vector.

6. Procedimiento para la producción de una molécula de unión, que es codificada por un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 4, que comprende la cultivación del anfitrión no humano de acuerdo con la reivindicación 5 en unas condiciones adecuadas, y el aislamiento de la molécula de unión a partir del cultivo.

7. Molécula de unión, codificada por un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 4; o 40 producida con el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Anticuerpo o fragmento o derivado de un anticuerpo, que comprende por lo menos una molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 7, siendo el anticuerpo de manera preferida un anticuerpo monoclonal.

9. Composición, que comprende el ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 4, el vector de acuerdo con la reivindicación 5, el anfitrión de acuerdo con la reivindicación 5, la molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 7, y/o el anticuerpo o fragmento o derivado de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 8.

10. Composición de acuerdo con la reivindicación 9,

que es una composición farmacéutica y eventualmente, además de ello, contiene un vehículo farmacéuticamente compatible, un excipiente farmacéuticamente compatible o un diluyente farmacéuticamente compatible, o que es una composición de diagnóstico, o que es un estuche, que comprende el ácido nucleico, el vector, el anfitrión, la molécula de unión, y/o el anticuerpo o un fragmento o derivado de un anticuerpo, en uno o varios recipientes.

11. Ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 4, vector de acuerdo con la reivindicación 5, anfitrión de acuerdo con la reivindicación 5, molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 7, y/o anticuerpo o fragmento o derivado de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 8 para la utilización como un medicamento.

12. Utilización del ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 4, del vector de acuerdo con la reivindicación 5, del anfitrión de acuerdo con la reivindicación 5, de la molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 7, y/o del anticuerpo o fragmento o derivado de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 8 para la producción de una composición de diagnóstico para el análisis in-vitro de la capacidad de respuesta de un paciente a una terapia con una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10.

Secuencia de ADN de la HC de TGN1412 inclusive los intrones, las UTRs y un péptido director

FIGURA 1

Fig. 2: Secuencia de aminoácidos de la HC de TGN1412 inclusive un péptido director

Variantes observadas junto al extremo terminal de C en el caso de la expresión en células CHO

(...) SLGK ó (...) SLG

Secuencia de ADN de la LC de TGN1412 inclusive los intrones, las UTRs y un péptido director

Pos. 160 gac: 1.Codón de la VLR Pos. 478 aaa: último codón de la VLR Pos. 1164 tgt : último codón de kappa const. Pos. 2341 tag: STOP

FIGURA 3 Secuencia de aminoácidos de la LC de TGN1412 inclusive los péptidos directores FIGURA 4 Secuencia de ADN de la HC de TGN1112 inclusive los intrones, las UTRs y un péptido director

Pos. 160 gac: 1.Codón de la VHR Pos. 517 tca: último codón de la VHR Pos. 2341 aaa : último codón de IgG1 cons.

Pos. 2341 tga: STOP

FIGURA 5

Fig. 6: Secuencia de aminoácidos de la HC de TGN1112 inclusive un péptido director Secuencia de ADN de la LC de TGN1112 inclusive los intrones, las UTRs y un péptido director

Pos. 160 gac: 1er codón de la VLR Pos. 478 aaa: último codón de la VLR Pos. 1164 tgt : último codón de kappa cons.

Pos. 2341 tga: STOP

FIGURA 7 Secuencia de aminoácidos de la LC de TGN1112 inclusive los péptidos directores FIGURA 8

VRLC de TGN1113/TGN1412

Definición de CDR según Combinación de ABM y Kabat Kabat

CDR-L1 HASQNTYVWLN HASQNTYVWLN

CDR-L2 KASNLHT KASNLHT

CDR-L3 QQGQTYPYT QQGQTYPYT

Para la VRLC se han definido de igual manera las CDRs según los dos sistemas

VRHC de TGN1113/TGN1412

Definición de CDR según Combinación de ABM y Kabat Kabat

CDR-H1 GYTFTHYYIN HYYIN

CDR-H2 CTYPGNVNTNYNEKFKD CTYPGNVNTNYNEKFKD

CDR-H3 SHYGLDWNFDV SHYGLDWNFDV

FIGURA 17