Antagonista del péptido receptor Alfavbeta3 selectivo para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico.

Un compuesto antagonista de la integrina αvβ3, que muestra una afinidad selectiva para la integrina α

vβ3, que contiene un motivo RGD cíclico y dos restos C-terminales de equistatina covalentemente unidos por una secuencia espaciadora.

Antagonista del péptido receptor Alfavbeta3 selectivo para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las integrinas son miembros de una familia de receptores de superficie celular transmembrana heterodiméricos que desempeñan una función crucial en los procesos de adhesión célula-célula y célula-matriz (Hynes, R.O. Cell 1992, 69, 11-25) . Estos receptores consisten de una subunidad -α y una -β, que no se asocian covalentemente en las combinaciones definidas (Eble, J.A. Integrin-Ligand Interaction; Springer: Heidelberg, 1997; pág 1-40) . La mayoría de ellos reconoce la triada Arg-Gly-Asp (RGD) que se encuentra en muchas proteínas de la matriz extracelular (es decir, vitronectina) (Serini, G.; y otros. A sticky business. Exp. Cell. Res. 2005, in press) y desintegrinas de veneno de serpiente (Ruoslahti, E.; Pierschbacher, M. Cell 1986, 44, 517-518; D'Souza, S.E.; y otros Trends Biochem. Sci. 1991, 16, 246-250; Gould, R.J.; y otros Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1990, 195, 168-171) . Aún si diferentes integrinas reconocen diferentes proteínas que contienen la secuencia RGD, varios estudios han demostrado que los residuos de aminoácidos que flanquean la secuencia RGD de ligandos de alta afinidad modulan su especificidad de interacción con complejos de integrina. A pesar de los numerosos estudios reportados en la literatura, la selectividad del ligando hacia diferentes subtipos de integrina es aún un problema desafiante debido principalmente a que la mayoría de las estructuras 3D de los subtipos de integrina siguen siendo desconocidos (Marinelli, L.; y otros J. Med. Chem. 2004, 47, 4166-4177) .

Un miembro ampliamente estudiado de esta clase de receptor es la integrina αvβ3. Esta integrina se expresa muy fuerte en células endoteliales y de melanoma activadas, en contraste, se expresa débilmente en vasos sanguíneos quiescentes y melanomas pre-neoplásicos (Hood, J.D.; Cheresh, D.A. Nat. Rev. Cancer 2002, 2, 91-100) . Junto con la integrina αvβ5, se reporta que αvβ3 está involucrada en procesos fisiológicos que incluyen la angiogénesis y la reparación del tejido así como afecciones patológicas como la angiogénesis inducida por tumores (Eliceiri, B.P.; Cheresh, D.A. J. Clin. Invest. 1999, 103, 1227-1230; Kumar, C.C. Curr. Drug Targets 2003, 4, 123-131) , emigración e invasión de las células tumorales (Clezardin, P. Cell. Mol. Life Sci. 1998, 54, 541-548) . A pesar de que ambas integrinas promueven la adhesión celular a la vitronectina y participan en los mismos procesos, se reportaron como estructuralmente diseñadas para responder a diferentes eventos de señalización. Los estudios previos proporcionaron evidencia de que la angiogénesis inducida por bFGF es mediada por αvβ3 mientras que la angiogénesis inducida por VEGF es mediada por αvβ5 (Friedlander, M.; y otros Science 1995, 270, 1500-1502) . Las células de melanoma que expresan αvβ3 migran in vitro y hacen metástasis in vivo sin la necesidad de la estimulación de citocinas exógenas (Filardo, E.J.; y otros. J Cell Biol. 1995, 130, 441-450) . Por el contrario, las células tumorales que expresan la integrina αvβ5 requieren de un evento de señalización mediado por un receptor tirosina cinasa para la motilidad en vitronectina y la diseminación in vivo (Brooks, P.C.; y otros J Clin Invest. 1997, 99, 1390-1398) . Aunque αvβ5 se expresa ampliamente por muchas célula tumorales malignas, αvβ3 tiene una distribución celular relativamente limitada en comparación con la de αvβ5 (Pasqualini, R.; y otros J. Cell Science 1993, 105, 101-111; Walton, H.L.; y otros J. Cell. Biochem. 2000, 78, 674-680.) . Por lo tanto, con el fin de orientar los procesos mediados por αvβ3 a propósitos de diagnóstico o terapéuticos, se requiere el desarrollo de nuevos compuestos que puedan discriminar entre αvβ3 y αvβ5.

Hasta la fecha, varios candidatos terapéuticos, incluyendo los anticuerpos (Gutheil, J.C. y otros Clin. Cancer Res. 2000, 6, 3056-3061) , moléculas pequeñas (Miller, W.H.; y otros Drug Discov. Today 2000, 5, 397-408; Marugan, J.J.; y otros J. Med. Chem. 2005, 48, 926-934) , peptidomiméticos (Sulyok, G.A.; y otros J. Med. Chem. 2001, 44, 1938-1950; Belvisi, L.; y otros Org. Lett. 2001, 3, 1001-1004) , y péptidos cíclicos (Mitjans, F. y otros Int. J. Cancer 2000, 87, 716-723; Dechantsreiter, M.A.; y otros J. Med. Chem. 1999, 42, 3033-3040) se evaluaron clínicamente y mostraron que modulan exitosamente los procesos mediados por αvβ3. Hasta ahora, el pentapéptido ciclo (-Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMeVal-) , referido como c (RGDf[NMe]V) (Eskens, F.A.; y otros Eur. J. Cancer 2003, 39, 917-926) , es uno de los αvβ3 antagonistas más activos reportados en la literatura. Los estudios previos demostraron una mayor afinidad de este péptido por la integrinaαvβ3 en comparación con αvβ5 y se reportó la inhibición de la adhesión celular mediada por αvβ3 con valores de IC50 en el intervalo micromolar cuando se ensayó en diferentes líneas celulares tumorales (Goodman, S.L.; y otros. J. Med. Chem. 2002, 45, t045 -1051) .

Las estructuras cristalinas del segmento extracelular de la integrina αvβ3 en su estado no ligado y en el complejo con c (RGDf[NMe]V) y los estudios de acoplamiento en ligandos de integrina αvβ3 demostraron que las principales interacciones son entre la arginina cargada positivamente y la subunidad α y entre el ácido aspártico aniónico y la subunidad β (Marinelli, L.; y otros. J. Med. Chem.. 2003, 46, 4393-404; Xiong, J.P. y otros, Cr y stal structure of the extracellular segment of integrin αvβ3. Science 2001, 294, 339-345; Xiong, J.P.; y otros. Science 2002, 296, 151-155) , y que la selectividad entre las diferentes subunidades se consigue mediante la configuración molecular de la secuencia RGD. Estudios anteriores además reportaron que la equistatina, la más pequeña (49 residuos) de las desintegrinas de víbora (Echis carinatus) , es un potente antagonista de las integrinas αvβ3, αvβ1 y α11bβ3 (Wierzbicka-Patynowski, I.; y otros. J. Biol. Chem. 1999, 274, 37809-37814) y que los aminoácidos adyacentes al motivo RGD junto con los 41-49 residuos C-terminales parecen ser críticos para el reconocimiento selectivo de las integrinas. Experimentos de mutación y entrecruzamiento por fotoafinidad, y análisis conformacional NMR combinado con estudios de acoplamiento Yahalom, D.; y otros. Biochemistr y 2002, 41, 8321-8331; Saudek, V.; y otros. Biochemistr y 1991, 30, 7369-7372) , proporcionaron evidencias de que la región C-terminal de equistatina se une a un sitio dentro de la subunidad β3 del receptor αvβ3, que es distinto de los sitios que se unen a los residuos que flanquean la tríada RGD en pequeños péptidos ligandos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere a compuestos de péptidos o miméticos de péptido, que contienen la secuencia Arg-Gly-Asp, como antagonistas potentes y selectivos del receptor αvβ3: los compuestos de la invención se pueden usar como nuevos medicamentos contra el cáncer y/o una nueva clase de marcadores de diagnóstico no invasivos como herramientas adecuadas para la terapia orientada a αvβ3 e imagenología.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Es una representación esquemática de los péptidos sintetizados.

Figura 2. Muestra las curvas de inhibición representativas obtenidas a partir de ensayos de adhesión realizados en células Kαvβ3. Las células se preincubaron con concentraciones crecientes de c (RGDfV) (panel A, IC50 0.68 µM) y RGDechi (panel B, IC50 0.88 µM) durante 1 hora a 4°C y después se sembraron en placas recubiertas con vitronectina. Las células se dejaron adherir durante 1 hora a 37°C y finalmente se contaron.

Figura 3. Muestra la selectividad de RGDechi por αvβ3. Panel A. Curvas de inhibición representativas obtenidas a partir de ensayos de adhesión realizados en células Kαvβ5. Las células se preincubaron con concentraciones crecientes de c (RGDfV) (cuadrados cerrados) y RGDechi (cuadrados abiertos) durante 1 hora a 4°C y la adhesión se determinó como se describe en la Figura 2. Los resultados se expresan como el porcentaje de células adherentes considerando la muestra control sin tratar como 100%. Panel B Curvas de inhibición representativas obtenidas a partir de ensayos de adhesión realizados en células Kα11bβ3. Las células se pre-incubaron con anticuerpo monoclonal bloqueador LM609 anti-αvβ3y se sometieron al ensayo de adhesión sobre el fibrinógeno (10... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto antagonista de la integrina αvβ3, que muestra una afinidad selectiva para la integrina αvβ3, que contiene un motivo RGD cíclico y dos restos C-terminales de equistatina covalentemente unidos por una secuencia espaciadora.

2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene la siguiente fórmula (I) :

en donde:

10 AA1 es un aminoácido alfa que contiene al menos tres grupos funcionales, seleccionados en el grupo de Cys,

Asp, Glu, Lys, Orn, Pen, Dab o Dap;

AA2 es un aminoácido alfa que contiene al menos tres grupos funcionales, seleccionados en el grupo de Cys,

Asp, Glu, Lys. Orn, Pen, Dab o Dap;

15 L es una secuencia enlazadora que consiste en un número de residuos de aminoácido comprendido entre 0 y 2, tal como la secuencia PG;

(Xaa) n es una secuencia de aminoácido en la cual n está en el intervalo de 1 a 3, cuya secuencia corresponde a la secuenci.

2. 30 de Equistatina: MDD, y secuencias homólogas derivadas de las sustituciones conservativas de aminoácidos.

20 (Yaa) m es una secuencia de aminoácido en la m está en el intervalo de 2 a 9, cuya secuencia corresponde al C-terminal (41-49) de Equistatina: RNPHKGPAT, y secuencias homólogas derivadas de las sustituciones conservativas de aminoácidos.

3. Un compuesto de la fórmula (II)

25 A-[Y]Z-C (II)

en donde A es un péptido de fórmula general (I) ; z es un entero de 0 a 5; Y es una cadena espaciadora

30 respectivamente unida a una de las funcionalidades presentes en las cadenas laterales de los aminoácidos individuales presentes en el péptido A, o a un grupo N-terminal (-NH2) o un grupo C-terminal (-CO2H) de A, y a

C; cuando z es un entero entre 2 y 5, las unidades Y pueden ser iguales o diferentes entre sí;

Y que tiene la siguiente fórmula (III) :

35

en donde:

9

r, l, y q son cada uno independientemente 0 o 1, y p es independientemente un entero de 0 a 10, siempre que al menos uno de l, r y q sean diferente de cero;

R es hidrógeno;

R1 es hidrógeno o metilo;

C es un agente quelante, covalentemente unido al espaciador Y o directamente al péptido A, o a más de una de las unidades de aminoácido del péptido A, que es capaz de acomplejar un metal paramagnético o un radioisótopo o un radiotrazador.

4. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del antagonista αvβ3 de las reivindicaciones 1-3 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

5. Un compuesto antagonista de αvβ3 integrina de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 para usar como medicamento.

6. Un compuesto antagonista de αvβ3 integrina de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 para usar en el tratamiento de las patologías relacionadas con la angiogénesis y metástasis seleccionado del grupo que consiste de cáncer de mamas, tumores musculoesqueléticos, melanoma, cáncer de cabeza y cuello, glioma humano, cáncer

cervical, restenosis vascular, osteoporosis, artritis reumatoide.

7. Un kit diagnóstico o trazador que comprende el antagonista αvβ3 de las reivindicaciones 1-3 para la detección temprana en plasma o diagnóstico por MRI o medicina nuclear del cáncer de mamas, tumores musculoesqueléticos, melanoma, cáncer de cabeza y cuello, glioma humano, cáncer cervical, restenosis vascular, osteoporosis, artritis reumatoide.