Análisis de pronóstico para determinar la respuesta de células T a antígenos HLA y uso del mismo en el campo del trasplante de tejidos.

Un método in vitro para determinar si un individuo corre el riesgo de,

o está sometido a, daño o rechazo del injerto de origen inmunitario y/o daño de origen inmunitario contra tejido no injertado, en donde el injerto es un aloinjerto o un xenoinjerto, comprendiendo el método:

(a) someter a ensayo si el individuo tiene células T que responden a un péptido de 9 a 30 aminoácidos incluyendo al menos un epítopo de células T que se une al MHC de clase II, comprendiendo dicho péptido una secuencia de aminoácidos contiguos del dominio α3 y/o del dominio transmembrana de una molécula del MHC de clase I que es reconocida por una célula T que reconoce un epítopo de una molécula del MHC de clase I; y

(b) determinar de ese modo si el individuo corre el riesgo, o está sometido a, daño o rechazo del injerto de 10 origen inmunitario y/o daño de origen inmunitario contra tejido no injertado.

Análisis de pronóstico para determinar la respuesta de células T a antígenos HLA y uso del mismo en el campo del trasplante de tejidos

Campo de la invención La invención se refiere a un método de pronóstico.

Antecedentes de la invención Las diferencias genéticas entre las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad constituyen la barrera predominante contra el trasplante de órganos sólidos y de médula ósea. En los seres humanos estas moléculas se conocen como antígenos leucocitarios humanos (HLA) . Hay dos tipos principales de HLA denominados clase I y clase II.

El análisis de la respuesta inmunitaria de un individuo a los HLA puede permitir opciones que deben tomarse con respecto a la idoneidad de un potencial donante de trasplante y con respecto a la estrategia de tratamiento que se usa para prevenir la posterior pérdida del trasplante. El fracaso de un trasplante es determinado por varios factores, por ejemplo la tasa de fracaso de los primeros trasplantes renales de donantes fallecidos es de aproximadamente 3% anual después del primer año, pero es considerablemente mayor en los re-trasplantes. La única estrategia disponible en la actualidad para identificar las respuestas inmunitarias en contra de un trasplante alogénico implica la detección de anticuerpos contra HLA (y, a veces otras moléculas tales como MIICA) . La detección preoperatoria de donantes con anticuerpos anti-HLA específicos (DSA) contraindica el trasplante. La presencia de anticuerpos anti-HLA durante el curso de post-trasplante se asocia con la disminución de la supervivencia del injerto y la identificación histológica de rechazo mediado por anticuerpos ya sea aguda o crónica. La detección de anticuerpos anti-HLA es específica ya que su presencia está estrechamente asociada con un aumento de la frecuencia de fracaso del injerto, pero carece de sensibilidad debido a que la mayoría de los fallos de injerto no están asociados con DSA anti-HLA.

Además, una proporción de los trasplantes da como resultado daños de origen inmunitario a tejido no-injertado. Este daño se caracteriza típicamente como enfermedad de injerto contra anfitrión (EICA) . La EICA es una complicación importante del trasplante alogénico, particularmente del trasplante de médula ósea (TMO) . Se puede clasificar en presentaciones agudas y crónicas por motivos cronológicos y clínicos. La EICA crónica (EICAc) implica generalmente una gama más amplia de órganos que la EICA aguda (EICAa) y en muchos aspectos se asemeja a una enfermedad autoinmunitaria en los no trasplantados. Se diagnostica actualmente mediante criterios clínicos e histopatológicos. Al igual que con otros trastornos de trasplantes, hay algunos indicios de una asociación con los anticuerpos, en este caso anticuerpos tales como anticuerpos anti-nucleares (ANA) , anti-mitocondriales (AMA) , antimúsculo liso (ASMA) , anti-cardiolipina (ACLA) , anti-microsomales de hígado y riñón (LKM) , anti-ADN, antineutrófilos citoplasmáticos (ANCA) , y anti-tiroides. Sin embargo, al igual que con otros trasplantes, esta asociación no es fiable en la predicción o diagnóstico de la EICA.

Por tanto, existe una necesidad de análisis alternativos para predecir los resultados del trasplante en general y de ese modo planear las estrategias de tratamiento.

Compendio de la invención La patogénesis del rechazo del injerto (en particular, el rechazo crónico del injerto) es poco conocida. La incapacidad de los análisis basados en anticuerpos para predecir con precisión el resultado indica que pueden estar ocurriendo respuestas inmunitarias más complejas. La invención descrita en la presente memoria se refiere a hallazgos sobre la respuesta inmunitaria a los fragmentos de péptidos de HLA de clase 1. Los autores de la presente invención han encontrado que los sujetos exhiben respuestas de células T a antígenos concretos de diversos dominios de la molécula de HLA de clase 1. Estos antígenos derivan de regiones de la molécula de HLA que están relativamente conservadas entre alotipos de HLA, por ejemplo, los dominios transmembrana y alfa-3. Por lo tanto, mediante la determinación de la reactividad de células T contra tales antígenos, se proporciona un método para identificar a los individuos en riesgo de sufrir daño o rechazo de injerto de origen inmunitario, y/o daño de origen inmunitario contra tejido no injertado. Se pretende que el rechazo del injerto al que se hace referencia en la presente memoria incluya cualquier respuesta por el sistema inmunitario de un sujeto receptor a un injerto u órgano trasplantado proporcionada por un donante. En consecuencia, la presente invención proporciona un método in vitro para determinar si un individuo corre el riesgo de, o está sometido a, daño o rechazo del injerto de origen inmunitario y/o daño de origen inmunitario contra tejido no injertado, en donde el injerto es un aloinjerto o un xenoinjerto, comprendiendo el método:

1. (a) comprobación de que el individuo tiene células T que responden a un péptido de 9 a 30 aminoácidos que incluyen al menos un epítopo de células T de unión al MHC de clase II, comprendiendo dicho péptido una secuencia de aminoácidos contiguos del dominio α3 y/o dominio transmembrana de una molécula del MHC de clase I que es reconocido por una célula T que reconoce un epítopo de una molécula del MHC de clase I; y

2. (b) determinar de este modo si el individuo corre el riesgo de, o está sometido a, daño o rechazo del injerto de origen inmunitario y/o daño de origen inmunitario contra tejido no injertado.

Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra una representación de la estructura 3D de la porción extracelular de la MHC de clase I humano, HLA-A2, que muestra los dominios α1, α2, α3, y transmembrana, y una β2 microglobulina unida a la misma. La Figura 2 muestra una representación esquemática de la porción extracelular de HLA-A2, que muestra las secuencias de aminoácidos y de ADN de los dominios α1, α2, α3, y transmembrana. La Figura 3 muestra una tabla que enumera 53 péptidos (p1 a p53) que cubren las regiones de HLA-A2, su peso molecular, y su secuencia real. Los 53 péptidos se utilizaron en los Ejemplos 1 y 2. La Figura 4 muestra los datos resultantes de los estudios de afinidad de unión en el Ejemplo 1 de los 53 péptidos que se muestran en la Figura 2 a una serie de moléculas del MHC II purificadas DR1, DR3, DR4, DR7, DR11, DR13, DR15, DR51, DR52-DRB5-DRB4, y DR53-DRB3 La Figura 5 muestra una representación esquemática de la porción extracelular del MHC de clase humana de clase I, HLA-A2, y el péptido p39 (residuos 192 a 206 de HLA-A2) . La Figura 6 muestra una representación esquemática de la porción extracelular del MHC de clase humana de clase I, HLA-A2, y los péptidos p50 (residuos 268 a 282 de HLA-A2) y p51 (residuos 270 a 284 de HLA-A2) . La Figura 7 muestra una representación esquemática de la porción extracelular del MHC de clase humana de clase I, HLA-A2, y los péptidos p52 (residuos 280 a 294 de HLA-A2) y p53 (residuos 282 a 296 de HLA-A2) . La Figura 8 muestra un gráfico de barras que muestra los datos del recuento ELISPOT de células reactivas/500.000 PBMC en un solo paciente para los péptidos estudiados en el Ejemplo 1. La Figura 9 muestra los datos resultantes de los estudios de afinidad de unión en el Ejemplo 1 de los 53 péptidos que se muestran en la Figura 2 a una serie de moléculas del MHC II purificadas DR1, DR3, DR4, DR7, DR11, DR13, DR15, DR51, DR52-DRB5-DRB4, y DR53-DRB3. Las IC50 expresadas en nM se evaluaron a partir de al menos tres experimentos independientes para cada uno de los 53 péptidos diferentes. Los péptidos de referencia biotinilados fueron buenos aglutinantes para las moléculas HLA-DR y exhibieron las siguientes CI50: 306-318 HA (PKYVKQNTLKLAT) para HLA-DRB1*0101 (1 nM, pH 6) , HLADRB1*0401 (22 nM, pH 6) , HLA-DRB1*1101 (19 nM, pH 5) y HLA-DRB5*0101 (8 nM, pH 5, 5) ; YKL (AAYAAAKAAALAA) para HLADRB1*0701 (6 nM, pH 5) ; MT 2-16 (AKTIAYDEEARRGLE) para DRB1*0301 (303 nM, pH 4, 5) ; B1 21-36 (TERVRLVTRHIYNREE) para HLA-DRB1*1301 (131 nM, pH 4, 5) ; A3 152-166 (EAEQLRAYLDGTGVE) para HLA-DRB1*1501 (59 nM, pH 4, 5) ; LOL 191-210 (ESWGAVWRIDTPDKLTGPFT) para HLA-DRB3*0101 (20 nM, pH 5, 5) y E2/E168 (AGDLLAIETDKATI) para HLA-DRB4*0101 (27 nM, pH 5) . * Significa pares adyacentes de péptidos utilizados combinados en análisis funcionales posteriores. La Figura 10 muestra el historial de edad, sexo, tipo de tejido, trasplante, transfusión y sensibilización de los sujetos de estudio en el Ejemplo 2. Los diferentes grupos de pacientes se definen sobre la base de la presencia de HLA-A2 en el sujeto y su producción de anticuerpos contra HLA-A2 u otro HLA. Grupo 1: HLA-A2 negativo con anticuerpos contra... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para determinar si un individuo corre el riesgo de, o está sometido a, daño o rechazo del injerto de origen inmunitario y/o daño de origen inmunitario contra tejido no injertado, en donde el injerto es un aloinjerto o un xenoinjerto, comprendiendo el método:

(a) someter a ensayo si el individuo tiene células T que responden a un péptido de 9 a 30 aminoácidos incluyendo al menos un epítopo de células T que se une al MHC de clase II, comprendiendo dicho péptido una secuencia de aminoácidos contiguos del dominio α3 y/o del dominio transmembrana de una molécula del MHC de clase I que es reconocida por una célula T que reconoce un epítopo de una molécula del MHC de clase I; y

(b) determinar de ese modo si el individuo corre el riesgo, o está sometido a, daño o rechazo del injerto de origen inmunitario y/o daño de origen inmunitario contra tejido no injertado.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde:

- el individuo requiere o ha recibido un injerto; y/o

- el individuo tiene o no tiene una respuesta de anticuerpo a una molécula del MHC de clase I; y/o

- el daño o rechazo del injerto es daño o rechazo del injerto agudo o crónico; y/o

- el daño de origen inmunitario al tejido no injertado es daño agudo o crónico.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde se mide una respuesta inmunitaria de células T a dicha molécula poniendo en contacto el péptido con células T en una muestra tomada del sujeto, en condiciones que permitan que el péptido y las células T interactúen; y determinando si cualquiera de las células T es estimulada o no y determinando de ese modo si está presente o ausente una respuesta inmunitaria de células T.

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el injerto es un injerto o trasplante de órganos, y opcionalmente en donde el órgano es pulmón, hígado, corazón, piel, médula ósea o riñón.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el individuo tiene, se sospecha que tiene, o se considera que corre el riesgo de, rechazo de injerto crónico.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el injerto es médula ósea y en donde el tejido no injertado es al menos uno seleccionado entre hígado, piel, mucosa, tracto gastrointestinal, pulmones, ojo, timo, tejido conectivo, y glándula exocrina.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el individuo tiene, se sospecha que tiene, o se considera que corre el riesgo de Enfermedad de Injerto Contra Anfitrión (EICA) , particularmente EICA crónica.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la molécula del MHC de clase I es HLA-A, HLA-B o HLA-C, y preferiblemente HLA-A2.

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que se lleva a cabo como se ha definido en la reivindicación 3 y las células T están presentes en una población de PBMC aislada de una muestra de sangre o suero tomada del individuo.

10. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde la determinación de si las células T del individuo reconocen el péptido se lleva a cabo midiendo la producción de una citoquina por las células

T.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la citoquina es interferón gamma.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 10 o 11, en donde la producción de citoquina es detectada mediante un análisis ELISPOT.

13. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde la molécula del MHC de clase I es HLA-A2, y en donde el dominio α3 es definido como residuos 183 a 274 del SEQ ID NO: 2, y el dominio transmembrana es definido como residuos 275 a 314 del SEQ ID NO: 2.

14. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el péptido consiste en la secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 42, 43, 48, 49, 53 a 74, 97 a 120 y 129 a 132.