Vectores y secuencias para el tratamiento de enfermedades.

La presente invención proporciona nuevas secuencias,

construcciones génicas, vectores y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades y en especial, para el tratamiento de la mucopolisacaridosis.

VECTORES Y SECUENCIAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES

CAMPO DE LA INVENCiÓN

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

El lisosoma es un orgánulo que se encuentra en el citoplasma de células eucariotas, que sirve como almacenamiento para muchas enzimas hidrolíticas y como centro para degradar y reciclar componentes celulares. Este orgánulo contiene varios tipos de enzimas hidrolíticas, incluyendo proteasas, nucleasas, glicosidasas, lipasas, fosfolipasas, fosfatasas y sulfatasas. Todas las enzimas son hidrolasas ácidas.

Las enfermedades de almacenamiento lisosómico (LSD) son causadas por defectos genéticos que afectan a una o más enzimas lisosómicas. Estas enfermedades genéticas en general son resultado de una deficiencia de una actividad enzimática particular presente en el lisosoma. En menor medida, estas enfermedades pueden deberse a deficiencias en proteínas implicadas en la biogénesis lisosómica.

Las LSD son raras individualmente, aunque como grupo, estos trastornos son relativamente comunes en la población general. La prevalencia combinada de LSD es aproximadamente 1 por 5.000 nacidos vivos. Véase Meikle P, et al., JAMA 1999; 281 :249-254. Sin embargo, algunos grupos dentro de la población general están particularmente afectados por una alta incidencia de LSD. Por ejemplo, las tasas de prevalencia de las enfermedades de Gaucher y Tay-Sachs en descendientes de personas judías originarias de Europa central y oriental (asquenazíes) es de 1 por 600 y 1 por 3.900 nacimientos, respectivamente. La población finesa también está afectada por una tasa de prevalencia de LSD anormalmente alta.

La mucopolisacaridosis de tipo III (MPSIII) , conocida colectivamente como síndrome de Sanfilippo, son LSD causadas por una deficiencia en una de las enzimas implicadas en la degradación del heparán sulfato, que conduce a su acumulación patológica. La MPSIII se clasifica en 4 subtipos dependiendo de la deficiencia de la enzima. La pérdida de actividad de la sulfamidasa produce el subtipo lilA y se ha descrito que es la más grave, con la aparición más temprana de la enfermedad y la supervivencia más corta. Los síntomas de la MPSIIIA aparecen en los primeros años de vida, y se caracterizan por la neurodegeneración grave que conduce al retardo mental profundo, agresividad, hiperactividad y alteraciones del sueño. Los pacientes pierden progresivamente la capacidad del lenguaje, de tragar y la coordinación motora básica. Además de los síntomas neurológicos, los pacientes con MPSIIIA padecen alteraciones no neurológicas, incluyendo hepato y esplenomegalia, malformaciones esqueléticas y de las articulaciones, así como diarrea frecuente e infecciones del tracto respiratorio. El empeoramiento progresivo de los síntomas tiene como resultado la muerte del paciente durante la adolescencia. Véase Neufeld E, Muenzer J., "The mucopolysaccharidoses" en Scriver C., et al., Eds., "The metabolic and molecular basis of inherited disease", (Mc Graw-Hill Publishing Co., New York, NY, EE.UU., 2001, pág. 3.421-3.452) .

Actualmente no hay cura para la MPSIIIA y, por lo tanto, los tratamientos que existen están orientados a paliar los síntomas de la enfermedad con el fin de mejorar la calidad de vida de los pacientes. Los trastornos de MPS se pueden tratar mediante trasplante de médula ósea o terapia de sustitución enzimática (TSE) . Ambos procedimientos están basados en la endocitosis de las enzimas lisosómicas desde medio extracelular y su traslado a los lisosomas por el receptor de manosa-6-fosfato (M6PR) presente en la membrana celular. Sin embargo, el trasplante de médula ósea ha demostrado ser ineficaz en el tratamiento de los pacientes con MPSIII. Véase Sivakamur P, Wraith J, J. Inherít. Metab. Oís. 1999; 22:849-850. Se ha probado ampliamente que la TSE es eficaz para contrarrestar la acumulación no neurológica en otras enfermedades de almacenamiento lisosómico, incluyendo la MPSI, II y VI. Véase Harmatz P, et al., J. Mol. Genet. Metab. 2008; 94:469-475; Muenzer J, et al., Genet. Med. 2006; 8:465-473; Y Wraith J, et al., J. Pedíatr. 2004; 144:581

588. Además del alto coste de estos tratamientos, se ha mostrado que la TSE no produce la corrección o la conservación de la función neuronal debido al insuficiente suministro de la enzima proporcionada de forma exógena a través de la barrera hematoencefálica (BHE) . Véase Enns G., Huhn S., Ne uros urg. Focus 2008; 24:E12. Más recientemente, se ha demostrado que la TSE de dosis alta es parcialmente satisfactoria para eliminar el almacenamiento en el SNC en la MPS VII, posiblemente debido a la saturación del M6PR y de los receptores de manosa, que conduce a una vida media más larga de la proteína circulante. Véase Vogler C., et al., Proc. Nat!. Acad. Scí. USA 2005; 102:1477714782. Este estudio demuestra que los niveles altos de la enzima en sangre durante periodos de tiempo largos se correlacionan con una mejor corrección de la patología. El suministro intracerebral e intra-LCR (líquido cefalorraquídeo) de la enzima se ha demostrado que también es eficaz para reducir la patología del SNC en ratones con MPS lilA. Véase Hemsley K., et al., Genes Braín Behav. 2008; 53 (2) :161-8, y Savas P., et al., Mol. Genet. Metab. 2004; 82:273

285. Sin embargo, este procedimiento es muy invasivo debido a la necesidad de múltiples inyecciones repetidas y podría aumentar el riesgo de daño y/o de infecciones en el cerebro.

Dadas las limitadas opciones terapéuticas actuales para la MPSIII, se necesitan procedimientos alternativos. La transferencia de genes podría proporcionar los medios para lograr una producción permanente de la enzima que falta a partir de una sola intervención. Los vectores adenoasociados (AAV) están surgiendo rápidamente como el vector de elección para muchas aplicaciones de terapia génica, debido a su alta eficacia de transducción y a su falta de patogenicidad. Los vectores AA V transducen de forma eficaz células postmitóticas y varios estudios preclínicos y clínicos han demostrado el potencial de la transferencia de genes mediada por vectores AA V para dirigir de forma eficaz la expresión sostenida de transgenes terapéuticos para una variedad de enfermedades. Véase Daya S, Berns K, Clín. Microbiol. Rev. 2008;

21: 583-593.

Se ha demostrado que la administración de un vector AAV5 que expresa simultáneamente sulfamidasa y el activador de sulfatasa SUMF1 en los ventrículos laterales de ratones recién nacidos con MPSIIIA es capaz de corregir muchas alteraciones neurológicas y del comportamiento. Véase Fraldi A, et al., Hum. Mol. Genet. 2007; 16:2693-2702. Sin embargo, esta propuesta de actuación tiene varios inconvenientes. Primero, se ha descrito que el promotor eMV utilizado se silencia. Segundo, los efectos a largo plazo de la coexpresión de la sulfamidasa y SUMF1 no se han probado aún. No está claro que la co-expresión de SUMF sea ni siquiera necesaria ni que proporcione algún beneficio adicional permanente en comparación con el tratamiento con la sulfamidasa sola. Tercero, los vectores AAV5 tienen una baja distribución en el parénquima, y lo que es más importante, la distribución de la sulfamidasa en el cerebro usando estos vectores no resulta en una transducción del tejido cerebral, y por tanto, no se consigue la corrección del fenotipo somático usando esta aproximación. Finalmente, Fraldi, 2007, supra, demostró la eficacia de la transferencia génica solamente en ratones neonatos con MPSIIIA. No se han descrito experimentos en ratones de más edad. Dado que la MPSIIIA se diagnostica normalmente a los 3-4 años de edad, el modelo animal en ratones neonatos no es apropiado para predecir los efectos de este tratamiento en seres humanos.

En vista de las dificultades para diagnosticar MPSIIIA al nacer, se ha propuesto el desarrollo de intervenciones terapéuticas que empiecen al comienzo de la edad adulta. Se ha descrito que la administración intravenosa de un vector lentiviral que expresa la sulfamidasa en el ratón adulto, dio como resultado una pequeña mejora del fenotipo del SNe, probablemente debido al rendimiento relativamente pobre de la transducción de estos vectores in vivo. Véase Mclntyre e, et al.,... [Seguir leyendo]

1. Una secuencia aislada de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85% con la SEO ID NO: 1 que codifica para la proteína SEO ID NO: 2.

2. La secuencia aislada de nucleótidos según la reivindicación 1, donde dicha secuencia es SEO ID NO: 1.

3. Una construcción génica que comprende la secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.

4. La construcción génica según la reivindicación 3, donde dicha construcción génica es un vector.

5. La construcción génica según la reivindicación 4, donde dicho vector es un vector de expresión.

6. El vector de expresión según la reivindicación 5, donde dicho vector es un vector adenoasociado.

7. El vector de expresión según la reivindicación 6, donde el serotipo es 1, 2, 5, 7, 8 ó 9.

8. El vector de expresión según la reivindicación 7, donde el serotipo es 9.

9. El vector de expresión según la reivindicación 6, que comprende un promotor CAG operativa mente unido a SEO ID NO: 1.

10. El vector de expresión AAV9-CAG-co-hu-SFMD según la reivindicación 9 donde el serotipo del vector adeno-asociado es 9.

11. El vector plasmídico pAAV-CAG-co-hu-SFMO según la reivindicación 10 con número de acceso OSM 24817.

12. El vector de expresión según la reivindicación 5, que comprende un promotor hAAT operativa mente unido a SEQ ID NO: 1.

13. El vector plasmídico pAAV-hAAT-co-hu-SFMO según la reivindicación 12 donde el serotipo del vector adeno-asociado es 8 ó 9.

14. El vector plasmídico pAAV-hAAT-co-hu-SFMO según la reivindicación 13 donde el serotipo del vector adeno-asociado es 9.

15. Una composición farmacéutica que comprende: la secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; o el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14.

16. La composición farmacéutica según la reivindicación 15, para administración parenteral, preferiblemente para administración intravenosa o intracisternal.

17. La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de: la secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; o el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14.

18. La composición farmacéutica según la reivindicación 15, que comprende una cantidad terapéutica mente eficaz del vector adeno-asociado de serotipo 9 según la reivindicación 9 para administración intracisternal.

19. La secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1

ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14; o la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 para su uso como medicamento.

20. La secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14; o la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 para aumentar la actividad de la sulfamidasa en el cuerpo.

21. La secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14; o la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 para su uso como un medicamento para la terapia de sustitución enzimática o la terapia génica, preferiblemente para la terapia génica.

22. La secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14; o la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 para el tratamiento de las mucopolisacaridosis, preferiblemente la mucopolisacaridosis de tipo III o el síndrome de Sanfilippo.

23. Un método para producir los vectores de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15 que comprende los pasos siguientes:

i) proporcionar un primer vector que comprende la SEQ ID NO: 1 entre una primera repetición terminal AA V Y una segunda repetición terminal AAV, un promotor CAG o hAA T operativamente unido a la SEQ ID NO: 1; un segundo vector que comprende un gen rep de AA V Y un gen cap de AAV; un tercer

vector que comprende el gen con función de "adenovirus he/per'; ii) cotransfectar células competentes con los vectores del paso (i) ; iii) cultivar las células transfectadas del paso (ii) ; y iv) purificar los vectores de expresión resultantes del cultivo del paso

(iii) .

24. Una célula aislada transfectada con: la secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; o el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14.

25. Un método para la fabricación de las composiciones farmacéuticas según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 que comprende combinar la secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14 y al menos un vehículo o un portador farmacéuticamente aceptable.

26. Uso de la secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14; o la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la mucopolisacaridosis tipo lilA.