Vectores quiméricos.

Un vector viral quimérico que comprende:

(a) una cápsida de virus adenoasociado (AAV) quimérica que comprende una inserción de aminoácido inmediatamente después de la posición del aminoácido 264 en una subunidad de la cápsida de AAV2 o un cambio correspondiente en otra subunidad de la cápsida de otro AAV;

y

(b) un ácido nucleico que comprende una secuencia repetida terminal de AAV y una secuencia de ácido nucleico heteróloga; donde el ácido nucleico está empaquetado dentro de la cápsida de AAV quimérica.

Vectores quiméricos Campo de la invención La presente invención se refiere a vectores virales quiméricos novedosos y a los métodos de elaboración y administración de los mismos.

Antecedentes de la Invención Cada vez está más claro que los vectores basados en virus adenoasociados (AAV) son los vectores de elección para ciertas aplicaciones de terapia génica tales como la liberación en el músculo. La utilización de vectores de AAV en tales protocolos se basa en las propiedades ventajosas de los AAV. Estas propiedades incluyen la carencia de patogenicidad y patología, la facilidad de preparación y purificación, la expresión a largo plazo en muchos tejidos incluyendo el músculo, y la carencia de una respuesta inmunitaria perjudicial mediada por células.

El serotipo 2 de AA V (AAV2) es el producto aislado de AAV mejor estudiado. A lo largo de la última década, se han realizado incursiones en la evaluación del tropismo tisular de serotipos alternativos de AAV. Estos estudios han demostrado que los distintos serotipos de AA V se pueden adaptar mejor a aplicaciones concretas. En este sentido, los serotipos 1, 6 Y 7 son los más prometedores para la liberación en el músculo esquelético. Por ejemplo, en comparación con AAV2, AAV1 se puede administrar a dosis más bajas (esto es, menos partículas) y puede expresar el transgén en momentos anteriores y a niveles de expresión superiores.

Los esquemas de purificación para AAV2 están bien definidos. Menos optimizados están los parámetros de purificación para algunos de los otros serotipos de AAV. Sería deseable diseñar una variante de AAV2 que mostrara propiedades ventajosas, tales como una intensificación del tropismo hacia el músculo de AAV1, 6 Y 7, pero que todavía conservara su facilidad de purificación. Incrementando la gama de vectores de AAV disponibles también se abordan asuntos adicionales relacionados con la re-administración y las respuestas inmunitarias.

Por consiguiente sería deseable tener disponible un conjunto más amplio de vectores de AAV.

Los vectores de AA V quiméricos presentan diferentes propiedades específicas de los serotipos (Bowles, 2003; J. Virol 77 (1) :423-432) . Las quimeras fueron identificadas mediante rescate de marcadores: la inserción de una secuencia de un AA V diferente en la cápsida del AA V defectuoso rescató la función, y además proporcionó ciertas propiedades características del serotipo donador.

El documento WO 01/68888 describe vectores de AAV con cápsidas quiméricas, que confieren un tropismo alterado que permite la elección como diana selectiva de células deseadas. Entre las quimeras se conciben virus AAV2 con cápsidas de AAV2/AAV1 híbridas.

Compendio de la Invención La presente invención proporciona vectores virales quiméricos que han sido diseñados para mostrar una o más propiedades de interés (p. ej., intensificación del tropismo hacia un tejido) . Por ejemplo, los autores de la presente invención han identificado el aminoácido clave de AAV1 responsable de la intensificación de la transducción in vivo y han manipulado selectivamente este aminoácido en el esqueleto de AAV2 y AAV3b. En realizaciones concretas, los virus quiméricos de la invención tienen una capacidad de transducción mejorada (p. ej., transducción de músculo esquelético, músculo cardíaco, células gliales, astrocitos, hígado, retina y/o pulmón, etc.) , niveles de expresión de transgenes mejorados y/o un comienzo más temprano de la expresión de los transgenes. El virus quimérico también puede tener una capacidad de transducción reducida con respecto a una o más células o tejidos (p. ej., hígado) , que puede ser deseable en términos de direccionamiento del vector al tejido diana de interés y reducción de la dosificación del vector que se va a administrar.

Con respecto a los virus quiméricos basados en AAV2, estas quimeras se pueden diseñar para que conserven una o más de las propiedades deseables de este serotipo (tal como la facilidad de purificación y la seguridad conocida) , a la vez que muestran algunas de las propiedades ventajosas de otros AA V, tales como AAV1, AAV6 y/o AAV7 (incluyendo una mejora de la transducción de músculo esquelético) , y/u otras propiedades de interés que no se observan en otros AAV o se presentan en un grado menor en otros AAV. Adicionalmente, en realizaciones concretas, el virus quimérico tiene un perfil inmunológico diferente del de uno o ambos virus parentales (esto es, sólo es débilmente reconocido o no es reconocido en absoluto por los antisueros neutralizadores contra el virus parental) , permitiendo de ese modo la administración a sujetos que tienen anticuerpos dirigidos contra el virus parental repetir la administración tras la administración de otro serotipo.

Por consiguiente, como un aspecto la invención proporciona un vector viral quimérico que comprende:

(a) una cápsida de un AAV quimérico que comprende una inserción selectiva de un aminoácido inmediatamente después de la posición del aminoácido 264 en una subunidad de la cápsida de AAV2 o un cambio correspondiente en una subunidad de la cápsida de otro AA V; y (b) un ácido nucleico que comprende una secuencia repetida terminal de AA V y una secuencia de 5 ácido nucleico heteróloga;

donde el ácido nucleico está empaquetado en el interior de la cápsida de un AAV quimérico.

Asimismo se describe un vector viral quimérico que comprende:

(a) una cápsida de un AA V quimérico que comprende: (i) una sustitución selectiva de aminoácido de una alanina por glutamina en la posición del 10 aminoácido 263 en una subunidad de la cápsida de AAV2; (ii) una inserción selectiva de aminoácido de una treonina después de la posición del aminoácido 264 en la subunidad de la cápsida de AAV2 (esto es, inmediatamente después de la posición del aminoácido 264) ; (b) un ácido nucleico que comprende una secuencia repetida terminal de AAV y una secuencia de ácido nucleico heteróloga; donde el ácido nucleico está empaquetado en el interior de la cápsida de un AAV quimérico. Asimismo se describe un vector viral quimérico que comprende: (a) una cápsida quimérica de AAV que comprende: (i) una sustitución selectiva de aminoácido de una alanina por una glutamina en la posición del aminoácido 263 de una subunidad de la cápsida de AAV3b;

(ii) una inserción selectiva de aminoácido de una treonina después de la posición del aminoácido 264 en la subunidad de la cápsida de AAV3b (p. ej., inmediatamente después de la posición del aminoácido 264) ; (b) un ácido nucleico que comprende una secuencia repetida terminal de AA V y una secuencia de ácido nucleico heteróloga;

donde el ácido nucleico está empaquetado en el interior de la cápsida de un AAV quimérico. Como otro aspecto más, la invención proporciona un vector viral quimérico que comprende: (a) una cápsida de un AAV quimérico que comprende una sustitución de aminoácido en la posición del aminoácido 450 y/o una sustitución de aminoácido en la posición del aminoácido 457 en una subunidad de la cápsida de AAV2 o un cambio correspondiente en una subunidad de la cápsida de otro AA V; 30 (b) un ácido nucleico que comprende una secuencia repetida terminal de AA V y una secuencia de ácido nucleico heteróloga; donde el ácido nucleico está empaquetado en el interior de la cápsida de un AAV quimérico. Asimismo se describe un vector viral quimérico que comprende: (a) una cápsida de un AAV quimérico que comprende una sustitución selectiva de aminoácido en la posición del 35 aminoácido 457 en una subunidad de la cápsida de AAV2 o un cambio correspondiente en la subunidad de la cápsida de otro AA V; (b) un ácido nucleico que comprende una secuencia repetida terminal de AA V y una secuencia de ácido nucleico heteróloga;

o donde el ácido nucleico está empaquetado en el interior de la cápsida de un AA V quimérico.

También se proporcionan formulaciones farmacéuticas que comprenden los vectores virales quiméricos de la invención.

La invención también proporciona los métodos in vitro de administración de un ácido nucleico a una célula que comprenden poner en contacto la célula con un vector viral quimérico o una formulación farmacéutica de la invención.

La invención también proporciona el uso de vectores virales quiméricos de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades.

Estos y otros... [Seguir leyendo]

1. Un vector viral quimérico que comprende:

(a) una cápsida de virus adenoasociado (AAV) quimérica que comprende una inserción de aminoácido inmediatamente después de la posición del aminoácido 264 en una subunidad de la cápsida de AAV2 o un cambio correspondiente en otra subunidad de la cápsida de otro AAV; y

(b) un ácido nucleico que comprende una secuencia repetida terminal de AAV y una secuencia de ácido nucleico heteróloga; donde el ácido nucleico está empaquetado dentro de la cápsida de AAV quimérica.

2. Un vector viral quimérico que comprende:

(a) una cápsida quimérica de un virus adenoasociado (AAV) que comprende una sustitución de aminoácido en la posición del aminoácido 450 y/o una sustitución de aminoácido en la posición del aminoácido 457 en una subunidad de la cápsida de AAV2 o un cambio correspondiente en una subunidad de la cápsida de otro AAV; y

(b) un ácido nucleico que comprende una secuencia repetida terminal de AAV y una secuencia de ácido nucleico heteróloga; donde el ácido nucleico está empaquetado dentro de la cápsida de AA V quimérica.

3. El vector viral quimérico de acuerdo con la reivindicación 1, donde la subunidad de la cápsida comprende adicionalmente al menos una sustitución de aminoácido en una o más de las posiciones de los aminoácidos 263, 450 Y 457 en una subunidad de la cápsida de AAV2, o un cambio correspondiente en una subunidad de la cápsida de otro AAV.

4. El vector viral quimérico de acuerdo con la reivindicación 1, donde la subunidad de la cápsida comprende adicionalmente al menos una sustitución de aminoácido en una o más de las posiciones de los aminoácidos 263, 705, 708 Y 716 en una subunidad de la cápsida de AAV2, o un cambio correspondiente en una subunidad de la cápsida de otro AAV.

5. El vector viral quimérico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el vector viral quimérico comprende una cápsida de AAV2 quimérica.

6. El vector viral quimérico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el vector viral quimérico comprende una cápsida de AAV3 quimérica, opcionalmente una cápsida de AAV3b.

7. El vector viral quimérico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3-4 y, en la medida que dependa de éstas, las reivindicaciones 5-6, donde el aminoácido insertado inmediatamente después de la posición del aminoácido 264 es arginina, serina, tirosina, glicina, alanina, asparragina, glutamina, prolina, treonina, lisina, ácido aspártico o ácido glutámico.

8. El vector viral quimérico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-4 y, en la medida que dependa de éstas, las reivindicaciones 5-6, donde la sustitución en la posición del aminoácido 263 es una sustitución de alanina por glutamina.

9. El vector viral quimérico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-3 y, en la medida que dependa de éstas, las reivindicaciones 5-6, donde la sustitución en la posición del aminoácido 450 es una sustitución de asparragina por treonina.

10. El vector viral quimérico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-3 y, en la medida que dependa de éstas, las reivindicaciones 5-6, donde la sustitución en la posición del aminoácido 457 es una sustitución de asparragina por glutamina.

11. El vector viral quimérico de acuerdo con cualquiera de la reivindicación 4 y, en la medida que dependa de éstas, las reivindicaciones 5-6, donde la sustitución en la posición del aminoácido 705 es una sustitución de alanina por asparragina.

12. El vector viral quimérico de acuerdo con cualquiera de la reivindicación 4 y, en la medida que dependa de éstas, las reivindicaciones 5-6, donde la sustitución en la posición del aminoácido 708 es una sustitución de alanina por valina.

13. El vector viral quimérico de acuerdo con cualquiera de la reivindicación 4 y, en la medida que dependa de éstas, las reivindicaciones 5-6, donde la sustitución en la posición del aminoácido 716 es una sustitución de asparragina por treonina.

14. El vector viral quimérico de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 4, donde se inserta una arginina, serina, tirosina, glicina, alanina, asparragina, glutamina, prolina, treonina, lisina, un ácido aspártico o un ácido

glutámico inmediatamente después de la posición del aminoácido 264 en una subunidad de la cápsida de AAV2 y se sustituye una alanina por glutamina en la posición del aminoácido 263 en la subunidad de la cápsida de AAV2.

15. El vector viral quimérico de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 4, donde se inserta una arginina, serina, tirosina, glicina, alanina, asparragina, glutamina, prolina, treonina, lisina, un ácido aspártico o un ácido glutámico inmediatamente después de la posición del aminoácido 264 en una subunidad de la cápsida de AAV3, opcionalmente en una subunidad de la cápsida de AAV3b, y se sustituye una alanina por glutamina en la posición del aminoácido 263 en la subunidad de la cápsida de AAV3, opcionalmente en la subunidad de la cápsida de AAV3b.

16. El vector viral quimérico de acuerdo con la reivindicación 4, donde se inserta una arginina, serina, tirosina, glicina, alanina, asparragina, glutamina, prolina, treonina, lisina, un ácido aspártico o un ácido glutámico inmediatamente después de la posición del aminoácido 264 en una subunidad de la cápsida de AAV2; donde se sustituye alanina por glutamina en la posición del aminoácido 263 en la subunidad de la cápsida de AAV2; se sustituye una alanina por asparragina en la posición del aminoácido 705 en la subunidad de la cápsida de AAV2; se sustituye una alanina por valina en la posición del aminoácido 708 en la subunidad de la cápsida de AAV2; y se sustituye una asparragina por treonina en la posición del aminoácido 716 en la subunidad de la cápsida de AAV2.

17. El vector viral quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1-16, donde la secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica un polipéptido, opcionalmente un polipéptido terapéutico.

18. El vector viral quimérico de la reivindicación 17, donde el polipéptido terapéutico se selecciona del grupo que consiste en: distrofina, mini-distrofina, utrofina, un factor de coagulación incluyendo el Factor VIII o el Factor IX, un factor de crecimiento incluyendo el factor de crecimiento de tipo insulínico 1, el factor de crecimiento de tipo insulínico 11, el factor de crecimiento derivado de plaquetas, el factor de crecimiento epidérmico, el factor de crecimiento derivado de fibroblastos, el factor de crecimiento derivado del nervio, el factor de crecimiento derivado de la glía, el factor de crecimiento transformante a o el factor de crecimiento transformante ~, un factor neurotrófico, un factor antiinflamatorio incluyendo el receptor soluble del factor de crecimiento transformante a o IRAP, antitripsina a1, aglucosidasa ácida lisosómica, ~-glucocerebrosidasa, a-galactosidasa A, una citoquina, un interferón incluyendo interferón ~, TRAIL, ligando FAS, endostatina, angiostatina, proteína reguladora transmembrana de la fibrosis quística, eritropoyetina, receptor de LDL, lipoproteína lipasa, ornitina transcarbamilasa, ~-globina, a-globina, espectrina, adenosina desaminasa, hipoxantina guanina fosforribosil transferasa, esfingomielinasa, hexosaminidasa lisosómica, cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada, una proteína morfogénica de hueso incluyendo VEGF y RANKL, inhibidor I de proteína fosfatasa, fosfolambano, serca2a, catalasa, tirosina hidroxilasa, superóxido dismutasa, leptina, proteína RP65, galanina, a-L-iduronidasa, una hormona incluyendo insulina o somatotropina, galactocerebrosidasa, fenilalanina hidroxilasa, receptor de LDL, CD4 soluble, productos génicos anti-apoptóticos, receptor de glutamato, una linfoquina, barkct, receptor adrenérgico ~2, calsarcina, enos, inos, un sarcoglicano, receptor de Fc, receptor de células T, ApoE, ApoC, un producto de genes suicidas, un producto de genes supresores de tumores, y cualquier combinación de los mismos.

19. El vector viral quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1-16, donde la secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica un ARN no traducido, opcionalmente un ARN antisentido o un ARN de interferencia (ARNi) .

20. El vector viral quimérico de la reivindicación 19, donde el ARN no traducido está dirigido a VEGF, el producto génico de resistencia a múltiples fármacos, miostatina, o repeticiones en el producto génico de la Enfermedad de Huntington.

21. Una composición farmacéutica que comprende el vector viral quimérico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-20 en un portador farmacéutica mente aceptable.

22. Un método de administración in vitro de un ácido nucleico a una célula, que comprende poner en contacto la célula con el vector viral quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1-20 o la formulación farmacéutica de la reivindicación 21.

23. El vector viral quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1-20 para su uso como medicamento.