Variantes de FGF y métodos para usar las mismas.

Una variante de FGF-2 que tiene al menos una sustitución de aminoácido en el bucle beta8-beta9,

en la que la variante se identifica por la SEQ ID NO:1, y en la que la al menos una sustitución es el reemplazo de asparagina en la posición 111 por un aminoácido seleccionado de glicina o arginina, caracterizándose además dicha variante de FGF-2 por al menos uno de los atributos siguientes comparada con el FGF-2 de tipo salvaje correspondiente: especificidad aumentada para un subtipo de receptor; actividad biológica incrementada mediada por al menos un subtipo de receptor con actividad equivalente o reducida mediada a través de otro subtipo de receptor; afinidad aumentada para al menos un subtipo de receptor; proliferación celular incrementada mediada a través de un subtipo de receptor.

Variantes de FGF y métodos para usar las mismas CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a mutantes y variantes de los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) con propiedades mejoradas y proporciona polipéptidos FGF, composiciones farmacéuticas que comprenden estas variantes y métodos para usar las mismas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Factores de Crecimiento de Fibroblastos y sus Receptores Los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) comprenden una gran familia de polipéptidos conservados evolutivamente implicados en una variedad de procesos biológicos incluyendo morfogénesis, angiogénesis y remodelado de tejidos así como en la patogénesis de numerosas enfermedades (revisado en Omitz, Bioessays 22, 108, 2000) . Los diferentes miembros de esta familia estimulan la proliferación de una amplio espectro de células, que varía de origen mesenquimal a epitelial y neuroectodérmico in vitro e in vivo. Los FGF se expresan en un patrón estricto temporal y espacial durante el desarrollo y tienen papeles importantes en la generación de patrones y en la formación de las extremidades (revisado en Omitz, Bioessays 22, 108, 2000) .

Los FGF son mitógenos potentes y son críticos en la regulación de muchos procesos biológicos incluyendo la angiogénesis, vasculogénesis, cicatrización de heridas, formación de extremidades, tumorogénesis y supervivencia celular. La respuesta biológica de las células a los FGF está mediada por receptores de la superficie celular específicos con una alta afinidad (Kd 20-500 pM) que poseen una actividad tirosina quinasa intrínseca y que se fosforilan después de la unión de FGF (Coughlin et al. J Biol. Chem. 263, 988, 1988) . Se han identificado cinco Receptores del Factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGFR) distintos, FGFR1-4 son proteínas quinasas transmembrana mientras que FGFR5 parece ser un receptor soluble. El dominio extracelular de los FGFR consiste en tres dominios semejantes a inmunoglobulina (semejantes a Ig) (D1, D2 y D3) , un dominio de unión a heparina y una caja ácida. El corte y empalme alternativo de los ARNm de los FGFR genera diferentes variantes de los receptores, incluyendo las formas FGFR3IIIb y FGFR3IIIc, cada una de las cuales tiene una especificidad de ligando única.

Otro componente funcional crítico en la activación del receptor es la unión a proteoglicanos tales como heparán sulfato. Los FGF no se unen ni activan los receptores de FGF en células que carecen de heparán sulfato endógeno. Se han propuesto diferentes modelos para explicar el papel de los proteoglicanos heparán sulfato (HSPG) en la señalización de los FGF, incluyendo la formación de un complejo terciario funcional entre FGF, FGFR y un HSPG (Yayon et al., Cell 64, 841, 1991; Faham et al, Curr. Opin. Struct. Biol. 8: 578, 1998) .

Desarrollo Óseo El proceso de la formación del hueso se inicia por la osificación endocondral y la osificación intramembranosa. La osificación endocondral es el mecanismo fundamental para la formación longitudinal del hueso mediante la cual el cartílago se reemplaza por hueso. Requiere la formación y degradación secuencial de las estructuras cartilaginosas en las placas de crecimiento que sirven como moldes para los huesos en desarrollo. Durante la osificación intramembranosa el hueso se forma directamente en los tejidos conectivos. Ambos procesos requieren la infiltración de osteoblastos y la deposición posterior de la matriz.

Se ha mostrado que la ruta se señalización estimulada por activación de los FGFR está implicada en varias etapas del desarrollo de las extremidades y de los huesos. Otros reguladores principales del crecimiento óseo incluyen péptidos natriuréticos (NP) , proteínas morfogenéticas óseas (BMP) , hormona del crecimiento (GH) , factores de crecimiento semejantes a la insulina (IGF) , glucocorticoides (GC) , hormona tiroidea (TH) , hormona paratiroidea (PTH) , péptido relacionado con PTH (PTHrP) y Vitamina D.

FGFR y Enfermedad Varios defectos de nacimiento que afectan al esqueleto están asociados con mutaciones en los genes que codifican los receptores de FGF, específicamente los síndromes de Crouzon, Pfeiffer, Jackson-Weiss, Apert y Beare-Stevenson (Kan, et. al., Am J Hum Genet 70, 472, 2002) . Las mutaciones en FGFR3 son responsables de la acondroplasia, la forma más común del enanismo genético humano (revisado en Vajo et al., Endocr. Rev. 21, 23, 2000) . Específicamente, el resultado de la mutación de la acondroplasia es un FGFR3 estabilizado, activado constitutivamente que da lugar a la maduración de los condrocitos restringida en la placa de crecimiento de los huesos largos y a huesos anormalmente acortados.

Los FGFR se han implicado en determinadas malignidades y enfermedades proliferativas. FGFR3 es el oncogén más frecuentemente mutado en el carcinoma de células transicionales (TCC) de la vejiga en el que está mutado en más del 30% de los casos (Cappellen et al., Nature Genet. 23 18, 1999) . Dvorakova et al. (Br. J. Haematol: 113, 832, 2001) han mostrado que la isoforma FGFR3IIIc está sobreexpresada en la células blancas de la sangre de los pacientes con leucemia mieloide crónica (CML) . Yee et al. (J. Natl. Cancer 92, 1848, 2000) identificaron una mutación en FGFR3 ligada al carcinoma cervical. Recientemente, se ha mostrado que FGFR4 está asociado con los tumores de la pituitaria (Ezzat, et al, J. Clin. Invest. 109, 69, 2002) y la progresión del cáncer de mama (Bange, et al., Cancer Res. 62, 840, 2002) .

Por el contrario, se ha mostrado que los FGF y sus análogos son útiles para tratar indicaciones que incluyen heridas (Patentes EEUU Nos. 4.950.483, 5.859.208 y 6.294.359) , infarto de miocardio (Patentes EEUU Nos. 4.296.100 y 4.378.347) , trastornos esqueléticos (Patentes EEUU Nos. 5.614.496 y 5.656.598) y para remodelar tejido cardiaco (Patente EEUU No. 6.352.971) .

Especificidad de Receptor Teniendo en cuenta el gran número de variantes de FGF y de receptor de FGF, una cuestión importante respecto a la función de los FGF es su especificidad de receptor. Todos los FGF ensayados hasta el momento se unen a FGF-1 (FGF ácido, aFGF) con moderada a alta afinidad, lo que demuestra una redundancia aparente en el sistema de FGF. A diferencia de FGFR1 y FGFR2, se ha encontrado que el tercer subtipo de receptor, FGF3, se une a FGF-8, FGF-17 y FGF-18 con alta afinidad y a FGF-9 con selectividad mejorada. La especificidad también puede conseguirse por proteoglicanos específicos expresados en diferentes tejidos (Ornitz, Bioessays, 22 108, 2000) . Se usaron mutagénesis dirigida a sitio y cristalografía de rayos X para estudiar la base de la especificidad de los FGF a sus receptores (Plotnikov et al., Cell 98 641, 1999; Plotnikov et al., Cell 101, 413, 2000; Stauber et al., PNAS 97 49, 2000; Pellegrini et al., Nature, 407. 1029, 2000; Schlessinger et al., Mol Cell, 6 43, 2000) .

Variantes de FGF

Todos los miembros de la familia de los FGF comparten un dominio de núcleo de homología de aproximadamente 120 aminoácidos, 28 residuos de aa están altamente conservados y seis son idénticos. Los estudios estructurales de varios FGF identificaron 12 cadenas P antiparalelas cada una adyacente a bucles P que comprenden la región de núcleo, conservada en la familia. El dominio de núcleo comprende los sitios de unión primarios a FGFR y a heparina. Las regiones de unión al receptor son distintas de las regiones de unión a heparina (revisado en Ornitz e Itoh, Gen. Biol. 2, 3005.1, 2001) .

Se han hecho intentos para conseguir una especificidad alterada para el receptor de FGF por deleciones o truncamientos de sus ligandos, mediante mutaciones introducidas en determinadas localizaciones en el gen que codifica las proteínas. La solicitud PCT en tramitación con la presente WO 02/36732 describe variantes de FGF que tienen al menos una mutación en el bucle P8-P9, que tienen una especificidad para el receptor incrementada para un subtipo de receptor comparada con el FGF de tipo salvaje correspondiente.

Varios investigadores han demostrado mutantes y variantes de FGF que afectan a la unión al receptor y a la heparina. Kuroda et al., (Bone, 25, 431, 1999) demostraron que un polipéptido FGF-4 de longitud completa y una versión acortada que contiene 134 residuos de aminoácidos presentan una proliferación celular y un efecto en el incremento de la densidad ósea comparables. La forma más corta de FGF-4 ensayada, que contiene sólo 111 residuos de aminoácidos, presentó una actividad limitada en la estimulación del crecimiento.

La Patente EEUU... [Seguir leyendo]

1. Una variante de FGF-2 que tiene al menos una sustitución de aminoácido en el bucle beta8-beta9, en la que la variante se identifica por la SEQ ID NO:1, y en la que la al menos una sustitución es el reemplazo de asparagina en la posición 111 por un aminoácido seleccionado de glicina o arginina, caracterizándose además dicha variante de FGF-2 por al menos uno de los atributos siguientes comparada con el FGF-2 de tipo salvaje correspondiente: especificidad aumentada para un subtipo de receptor; actividad biológica incrementada mediada por al menos un subtipo de receptor con actividad equivalente o reducida mediada a través de otro subtipo de receptor; afinidad aumentada para al menos un subtipo de receptor; proliferación celular incrementada mediada a través de un subtipo de receptor.

2. La variante según la reivindicación 1, en la que la variante comprende además al menos una mutación adicional que proporciona rendimiento o estabilidad aumentada de la variante, en la que la variante tiene una sustitución por glutamina en las posiciones de aminoácidos 3 y 5 como se identifica por la SEQ ID NO:4, o la variante tiene una sustitución por glutamina en las posiciones de aminoácidos 3 y 5 y una sustitución por glicina en la posición 111 como se identifica por la SEQ ID NO:5.

3. La variante según la reivindicación 1 que tiene una actividad de al menos 2 veces la actividad del FGF nativo en términos de proliferación inducida por la variante en células que presentan FGFR.

4. Un polinucleótido como se identifica por la SEQ ID NO:18, en el que el codón que codifica asparagina en la posición de nucleótid.

33. 333 se reemplaza por un codón que codifica glicina o arginina de manera que el polinucleótido resultante codifica una variante de FGF-2 que tiene al menos una sustitución de aminoácido en el bucle beta8-beta9, caracterizándose además dicha variante de FGF-2 por al menos uno de los atributos siguientes comparada con el FGF-2 de tipo salvaje correspondiente:

especificidad aumentada para un subtipo de receptor;

actividad biológica incrementada mediada por al menos un subtipo de receptor con actividad equivalente o reducida mediada a través de otro subtipo de receptor;

afinidad aumentada para al menos un subtipo de receptor;

proliferación celular incrementada mediada a través de un subtipo de receptor.

5. El polinucleótido según la reivindicación 4, en el que al menos otro codón está modificado de manera que el polipéptido resultante proporciona un rendimiento o estabilidad aumentada de la variante,

en el que los codones en las posiciones de nucleótidos 7-9 y 13-15 codifican cada uno glutamina como se identifica por la SEQ ID NO:21; o los codones en las posiciones de nucleótidos 7-9 y 13-15 codifican cada uno glutamina y el codón en las posiciones de nucleótido.

33. 333 codifica glicina como se identifica por la SEQ ID NO:22.

6. El polinucleótido según la reivindicación 4, en el que el polipéptido resultante tiene una actividad de al menos 2 veces la actividad del FGF nativo en términos de proliferación inducida por la variante en células que presentan FGFR.

7. Una composición farmacéutica que comprende como un ingrediente activo al menos una variante de FGF-2 según cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

8. La composición farmacéutica según la reivindicación 7,

formulada para administración por las vías intra-articular, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica o 5 intratecal; o formulada para administración en el sitio del trauma óseo o del cartílago, comprendiendo además preferiblemente una matriz.

9. Uso de una variante de FGF-2 según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado de trastornos esqueléticos relacionados con FGFR y 10 trastornos proliferativos relacionados con FGFR.

10. El uso según la reivindicación 9, en el que el trastorno es trastorno esquelético, preferiblemente para estimular o aumentar la cicatrización de fracturas óseas, procesos de crecimiento óseo, crecimiento o reparación de cartílago; o para mejorar los procesos de cicatrización de heridas.

11. Uso de una variante de FGF-2 según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para la selección, proliferación o diferenciación de células madre, en el que se excluyen las células madre embrionarias humanas.

12. Un método para interconvertir selectivamente un polipéptido FGF de un mitógeno a un factor de diferenciación o de un factor de diferenciación a un mitógeno, que comprende la etapa de generar una variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-3.