Una vacuna que comprende LOS L3V y LOS L3 de cepas de Neisseria,

en la que los LOS L3 y L3V tienen lasiguiente estructura: **Fórmula**

en la que para el LOS L3V:

R1≥**Fórmula**

R2 ≥ PEA,

R3 ≥ PEA,

R4 ≥ H o OAc, R5 ≥ H, PEA, o Gly,

Y en la que para el LOS L3:

R1 ≥**Fórmula**

R2 ≥ PEA,

R3 ≥ H,

R4 ≥ H o OAc,

R5 ≥ H o Gly

que además comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable

Vacunas LOS L3V

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de las composiciones de vacunas contra neisseria, a su fabricación y al

uso de dichas composiciones en medicina. Más particularmente, se refiere a procedimientos de para fabricar nuevas cepas meningocócicas modificadas mediante ingeniería que sean más adecuadas para la producción de vacunas, en particular de vesícula de membrana externa (o ampolla) de neisseria, en particular, meningocócicas. También se describen procedimientos y productos de vacuna ventajosos basándose en el uso de novedosas vacunas de la subunidad LOS o de vesícula de membrana externa (o ampolla) meningocócica que se han convertido en más seguras y más eficaces para el uso en sujetos humanos.

Antecedentes de la invención

Neisseria meningitidis (meningococo) es una bacteria gramnegativa aislada frecuentemente del tracto respiratorio superior humano. Es una causa de enfermedades bacterianas invasivas graves, tales como bacteriemia y meningitis. La incidencia de enfermedad meningocócica muestra diferencias geográficas, estacionales y anuales

(Schwartz, B., Moore, P. S., Broome, C. V.; Clin. Microbiol. Rev. 2 (Suplemento) , S18-S24, 1989) . La bacteria se clasifica habitualmente de acuerdo con el serogrupo de su polisacárido capsular.

La mayor parte de la enfermedad en países templados se debe a cepas del serogrupo B y varía en incidencia entre 1-10/100.000/año de la población total, alcanzando en ocasiones valores más altos (Kaczmarski, E. B. (1997) , Commun. Dis. Rep. Rev. 7: R55-9, 1995; Scholten, R. J. P. M., Bijlmer, H. A., Poolman, J. T. y col. Clin. Infect. Dis.

16: 237-246, 1993; Cruz, C., Pavez, G., Aguilar, E., y col. Epidemiol. Infect. 105: 119-126, 1990) .

Las epidemias dominadas por meningococos del serogrupo A, en su mayor parte en África central, alcanzan en ocasiones niveles de incidencia de hasta 1.000/100.000/año (Schwartz, B., Moore, P. S., Broome, C. V. Clin. Microbiol. Rev. 2 (Suplemento) , S18-S24, 1989) . Prácticamente todos los casos como una totalidad de la enfermedad meningocócica están provocados por meningococos de los serogrupos A, B, C, W-135 e Y, y existe una

vacuna de polisacárido capsular tetravalente A, C, W-135, Y (Armand, J., Arminjon, F., Mynard, M. C., Lafaix, C, J. Biol. Stand. 10: 335-339, 1982) .

La frecuencia de las infecciones por Neisseria meningitidis ha aumentado en las últimas décadas en muchos países europeos. Esto se ha atribuido a un aumento de la transmisión debido a un aumento de las actividades sociales (por ejemplo, piscinas, teatros, etc.) . Ya no es infrecuente aislar cepas de Neisseria meningitidis que son menos sensibles o resistentes a algunos de los antibióticos convencionales. Este fenómeno ha generado unas necesidades médicas no satisfechas de nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, procedimientos de selección de fármacos y pruebas diagnósticas para este organismo.

Las vacunas de polisacáridos disponibles se están mejorando actualmente conjugando químicamente las mismas a proteínas transportadoras (Lieberman, J. M., Chiu, S. S., Wong, V. K., y col. JAMA 275: 1499-1503, 1996) .

Sin embargo, no se dispone de una vacuna de serogrupo B. Se ha observado que el polisacárido capsular de serogrupo B no es inmunogénico, muy probablemente debido a que comparte similitud estructural con componentes del huésped (Wyle, F. A., Artenstein, M. S., Brandt, M. L y col. J. Infect. Dis. 126: 514-522, 1972; Finne, J. M., Leinonen, M., Mäkelä, P. M. Lancet ii.: 355-357, 1983) . Por lo tanto, los esfuerzos se han centrado en intentar desarrollar vacunas de serogrupo B a partir de vesículas de membrana externa (o ampollas) o componentes de proteína purificados de las mismas.

Los antígenos meningocócicos alternativos para el desarrollo de vacunas son los lipooligosacáridos (LOS) meningocócicos. Estos son glucolípidos unidos a la membrana externa que difieren de los lipopolisacáridos (LPS) de las Enterobacteriaceae porque carecen de cadenas laterales O y, por tanto, se parecen a la forma general de LPS (Griffiss y col. Rev Infect Dis 1988; 10: S287-295) . La heterogeneidad en el resto de oligosacárido de los LOS 45 genera diversidad estructural y antigénica entre diferentes cepas meningocócicas (Griffiss y col. Inf. Immun. 1987;

55: 1792-1800) . Esto se ha usado para subdividir las cepas en 12 inmunotipos (Scholtan y col. J Med Microbiol 1994, 41: 236-243) . El inmunotipificación se realiza habitualmente por el procedimiento de Ouchterlony usando anticuerpos policlonales adsorbidos generados contra LOS de inmunotipo conocido (Poolman JT, Hopman CTP y Zanen HC, FEMS Microbiol Letters (1982) 13: 339-348) .. Los inmunotipos L3, L7 y L9 son inmunológicamente idénticos y son estructuralmente similares (o incluso iguales) y, por lo tanto, se han denominado L3, 7, 9 (o, para los fines de esta memoria descriptiva, de forma genérica "L3") . Los LOS meningocócicos L3, 7, 9 (L3) , L2 y L5 se pueden modificar por sialilación o mediante la adición de ácido citidina 5'-monofosfato-N-acetilneuramínico. Aunque los LOS L2, L4 y L6 se pueden distinguir inmunológicamente, son estructuralmente similares y cuando se menciona en el presente documento L2, dentro del alcance de la invención se puede sustituir opcionalmente con L4 o L6. Se

55 ha demostrado que los anticuerpos para LOS protegen contra infecciones en ratas de experimentación y contribuyen a la actividad bactericida en niños infectados por N. meningitidis (Griffiss y col J Infect Dis 1984; 150: 71-79) .

Sin embargo, un problema asociado al uso de LOS en una vacuna meningocócica es su toxicidad (debido a su resto de Lípido A) .

El LOS también está presente sobre la superficie de ampollas meningocócicas. Durante muchos años, los esfuerzos se han centrado en desarrollar vacunas a base de vesícula de membrana externa (o ampolla) meningocócica (de Moraes, J. C., Perkins, B., Camargo, M. C. y col. Lancet 340: 1074-1078, 1992; Bjune, G., Hoiby, E. A. Gronnesby,

J. K. y col. 338: 1093-1096, 1991) . Tales vacunas tienen la ventaja de incluir varias proteínas de membrana externa integrales en una conformación plegada apropiadamente que pueden provocar una respuesta inmunológica protectora cuando se administran a un huésped. Además, las cepas de Neisseria (incluyendo el serogrupo B de N. meningitidis - menB) excretan ampollas de membrana externa en cantidades suficientes para permitir su fabricación en una escala industrial. Sin embargo, con mayor frecuencia se preparan ampollas mediante procedimientos que comprenden una extracción con detergente al 0, 5 % (por ejemplo, desoxicolato) de las células bacterianas (por ejemplo, documento EP 11243) . Aunque esto se desea debido a la toxicidad de LOS (también denominado endotoxina) como se ha descrito anteriormente, también tiene el efecto de eliminar la mayor parte del antígeno LOS de la vacuna. Un problema adicional con el uso de LOS como un antígeno de vacuna es que existen 12 inmunotipos de LPS con una diversa variedad de estructuras de hidratos de carbono (M. P. Jennings y col, Microbiology 1999, 145, 3013-3021; Mol Microbiol 2002, 43: 931-43) . Los anticuerpos generados contra un inmunotipo no consiguen reconocer un inmunotipo diferente. Aunque los esfuerzos se han centrado en producir una región "central" genérica de las porciones de oligosacáridos de los inmunotipos de LOS (por ejemplo, documento WO 94/08021) , la actividad bactericida de anticuerpos generados contra el LOS modificado se pierde. Por tanto, puede que una vacuna necesite tener muchos componentes de LOS de inmunotipo diferente para ser eficaz. Existe un problema adicional con el uso de LOS (también conocido como LPS o lipopolisacárido) como antígenos en vacunas humanas, concretamente, que llevan estructuras de sacáridos que son similares a estructuras de sacáridos humanos (por ejemplo, en glóbulos rojos humanos) , planteando por tanto un problema de seguridad con su uso. Pero el cambio de la estructura de LOS es problemático debido a la sensibilidad estructural de la eficacia bactericida del antígeno LOS.

El documento WO 2004/014417 describe ciertas soluciones a estos problemas.

Los presentes inventores han encontrado además que:

- la decoración del núcleo interno de LOS es importante para definir el epítopo bactericida del inmunotipo,

- se ha demostrado que las combinaciones... [Seguir leyendo]

1. Una vacuna que comprende LOS L3V y LOS L3 de cepas de Neisseria, en la que los LOS L3 y L3V tienen la siguiente estructura:

en la que para el LOS L3V: R1=

R2 = PEA, R3 = PEA, 10 R4 = H o OAc, R5 = H, PEA, o Gly,

Y en la que para el LOS L3:

R1 =

R2=PEA, R3 = H, R4 = H o OAc, R5 = H o Gly

que además comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable.

2. La vacuna de la reivindicación 1, que comprende además LOS L10 de una cepa de Neisseria, aislado opcionalmente de una cepa A, B, C, W135 o Y de Neisseria meningitidis.

3. La vacuna de la reivindicación 1 o 2, en la que la composición comprende además LOS L4 de la estructura siguiente:

en la que para el LOS L4: 5 R1 =

R2 = H, R3 = PEA, R4 = OAc,

R5=Gly.

4. La vacuna de la reivindicación 3, en la que el LOS L4 tiene R4 = H en lugar de OAc y/o tiene R5 = H en lugar de Gly.

5. La vacuna de las reivindicaciones 1-4, en la que el LOS L3V se aísla de una cepa A, B, C, W135 o Y N. meningitidis.

15 6. La vacuna de las reivindicaciones 1-5, en la que el LOS L3 se aísla de una cepa A, B, C, W135 o Y de N. meningitidis.

7. La vacuna de las reivindicaciones 1-6, en la que LOS L3V, LOS L3, LOS L10, LOS L4, LOS L3V y L3, LOS L3V y L10, LOS L3 y L10, LOS L4 y L3V, LOS L4 y L3, LOS L4 y L10, LOS L3V y L3 y L10, LOS L3V y L3 y L4, LOS L3V y L4 y L10, LOS L3 y L4 y L10 o LOS L3V y L3 y L10 y L4 se conjugan con un vehículo de proeína.

20 8. La vacuna de las reivindicaciones 1-7, en la que LOS L3V, LOS L3, LOS L10, LOS L4, LOS L3V y L3, LOS L3V y L10, LOS L3 y L10, LOS L4 y L3V, LOS L4 y L3, LOS L4 y L10, LOS L3V y L3 y L10, LOS L3V y L3 y L4, LOS L3V y L4 y L10, LOS L3 y L4 y L10 o LOS L3V y L3 y L10 y L4 tienen un resto de lípido A destoxificado, que, por ejemplo, carece de una cadena de acilo secundaria consistente con el LOS que se ha aislado de una cepa msbB (-) de neisseria.

25 9. La vacuna de las reivindicaciones 1-8, en la que LOS L3V, LOS L3, LOS L10, LOS L4, LOS L3V y L3, LOS L3V y L10 LOS, L3 y LOS L10, LOS L4 y L3V, LOS L4 y L3, LOS L4 y L10, LOS L3V y L3 yL10, LOS L3V y L3 y L4, LOS L3V y L4 y L10, LOS L3 y L4 y L10 o LOS L3V y L3 y L10 y L4 están presentes en la composición inmunogénica como una preparación de LOS purificado.

10. La vacuna de las reivindicaciones 1-9, en la que LOS L3V, LOS L3, LOS L10, LOS L4, LOS L3V y L3, LOS L3V y L10, LOS L3 y L10, LOS L4 y L3V, LOS L4 y L3, LOS L4 y L10, LOS L3V y L3 y L10, LOS L3V y L3 y L4, LOS L3V y L4 y L10, LOS L3 y L4 y L10 o LOS L3V y L3 y L10 y L4 están presentes en la composición inmunogénica como una preparación de liposoma.

5 11. La vacuna de las reivindicaciones 1-10, en la que LOS L3V, LOS L3, LOS L10, LOS L4, LOS L3 V y L3, LOS L3 V y L10, LOS L3 y L10, LOS L4 y L3 V, LOS L4 y L3, LOS L4 y L10, LOS L3 V y L3 y L10, LOS L3V y L3 y L4, LOS L3 V y L4 y L10, LOS L3 y L4 y L10 o LOS L3 V y L3 y L10 y L4 está presentes en la composición inmunogénica como una preparación de ampolla.

12. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz de la vacuna de las reivindicaciones 1-11, uno

o más polisacáridos u oligosacáridos capsulares conjugados obtenidos de las siguientes cepas: Serogrupo A de meningococo, serogrupo C de meningococo, serogrupo W-135 de meningococo, serogrupo Y de meningococo y H. influenzae de tipo b, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. Un uso de la vacuna de las reivindicaciones 1-11 o la vacuna de la reivindicación 12 en la fabricación de un

medicamento para la prevención o el tratamiento de enfermedad provocada por uno o más serogrupos de N. 15 meningitidis seleccionados entre la siguiente lista: A, B, C, W135 e Y.

14. Una vacuna de las reivindicaciones 1-12 para usar en la prevención o el tratamiento de enfermedad provocada por uno o más serogrupos de N. meningitidis seleccionados entre la siguiente lista: A, B, C, W135 e Y.

15. Un procedimiento para fabricar la vacuna de las reivindicaciones 1-12, que comprende la etapa de aislar el

LOS L3V y el LOS L3, combinar los LOS L3V y L3 y formular los LOS L3V y L3 con un excipiente farmacéuticamente 20 aceptable.

16. Una composición inmunogénica que comprende LOS L3V de una cepa de Neisseria para usar en la prevención

o el tratamiento de enfermedad por inmunotipo L2 de N. meningitidis o una composición inmunogénica que comprende LOS L2 de una cepa de Neisseria para usar en la prevención o el tratamiento de enfermedad por inmunotipo L3V, en el que el LOS L3V tiene la estructura siguiente:

en la que: R1 =

R2 = PEA, R3 = PEA, R4 = H o OAc, R5 = H, PEA oGly.

17. La composición inmunogénica de la reivindicación 16, en la que el LOS L2 tiene la estructura siguiente:

en la que: R1 =

R2 = Glc, R3 = PEA, R4 = H o OAc, R5 = H, PEA oGly.