La invención se relaciona con el uso de CD98 como marcador de receptividad endometrial lo que permite el desarrollo de métodos para determinar el momento óptimo para que tenga lugar la implantación del blastocisto basados en la determinación del nivel de expresión de CD98 en el tejido endometrial a lo largo del ciclo.

La invención se refiere también a métodos para aumentar la receptividad del endometrio basados en el aumento de los niveles de CD98 así como a composiciones anticonceptivas basadas en el uso de inhibidores de CD98.

Uso de CD98 como marcador de receptividad endometrial.

Campo de la invención La invención se relaciona con la identificación de marcadores adecuados para determinar el estado de receptividad del endometrio así el uso de dichos marcadores y de inhibidores de los mismos para modular la receptividad del endometrio a la implantación del blastocisto.

Antecedentes de la invención La receptividad endometrial es un periodo autolimitado en el que el epitelio endometrial adquiere un estado oválico funcional y transitorio dependiente de esteroides que permite la adhesión del blastocisto. En seres humanos, el epitelio endometrial luminal adquiere este estado simultáneamente con el desarrollo de decidualización en el compartimento estromal (Popovici, R.M. et al. 2000. Endocrinology 141:3510-3513) , que se debe principalmente a la presencia de progesterona después de la sensibilización apropiada con 17β-estradiol. Este periodo, denominado “ventana de implantación”, dura desde los días 4-5 hasta los días 9-10 después de la producción o administración de progesterona. La ventana receptiva en seres humanos está limitada de esta manera a los días 19-24 del ciclo menstrual (Navot, D. et al. 1991. J Clin Endocrinol Metab 72:408-414) .

Para volverse receptivo, el endometrio sufre modificaciones estructurales y bioquímicas inducidas mediante regulación génica específica. Los cambios morfológicos, incluyen modificaciones en la membrana plasmática y el citoesqueleto. Los cambios bioquímicos dependen de una comunicación cruzada entre el endometrio materno y el blastocisto que es esencial para el progreso a través de cada fase de la implantación (Dominguez, F. et al. 2005. FASEB J 19:10561060) . El conocimiento de las bases moleculares de la receptividad endometrial es fundamental para el entendimiento de la reproducción humana.

La implantación embrionaria implica los pasos secuenciales de aposición, unión e invasión (Dominguez, F. et al. 2005. FASEB J 19:1056-1060) . Similar a la situación con los leucocitos durante la extravasación, la primera interacción parece basarse en ligandos de hidrato de carbono de L-selectina expresada en el epitelio luminal en el periodo de implantación. Sin embargo, ratones deficientes en L-selectina no tienen problemas de fertilidad (Robinson, S .D. et al. 1999. Proc Natl Acad Sci USA 96:11452-11457) . Además de L-selectina, las moléculas de adhesión celular mejor caracterizadas en la superficie luminal del endometrio son la integrina αvβ3 y su ligando osteopontina, que se ha encontrado repetidamente en estudios genómicos de endometrio receptivo humano. Los estudios con ratones deficientes revelan un papel crucial para la integrina β1 en la implantación, pero la deficiencia de varias subunidades α (α4, α5, α6ó αv) no produce fenotipo de implantación.

La receptividad endometrial probablemente no está determinada exclusivamente por la expresión de moléculas de adhesión selectivas, y también es probable que sean importantes una serie de reorganizaciones en el citoesqueleto. Los pinópodos endometriales son estructuras dependientes de hormonas que aparecen en el periodo de implantación en la membrana apical del endometrio epitelial y representan sitios de unión preferente de blastocistos. Las microvellosidades y estructuras adhesivas especializadas tales como estructuras endoteliales de acoplamiento están enriquecidas en microdominios de tetraspaninas.

A pesar de que se han descrito muchos marcadores bioquímicos para determinar la receptividad endometrial (Giudice, L. C. 1999. Hum Reprod 14 Suppl 2:3-16; Achache, H et al.; Human Reproduction Update, 2006; 12:73146, Thomas, K et al.; Fértil. Steril. 2003; 80:502-507; WO03062832) , existe la necesidad de encontrar un marcador efectivo que tenga aplicación en clínica y que se exprese exclusivamente durante la ventana de implantación.

Compendio de la invención En un primer aspecto, la invención se relaciona con el uso de CD98 como marcador de receptividad del endometrio para la implantación del embrión.

En un segundo aspecto, la invención se relaciona con un método para seleccionar la ventana temporal para la implantación del embrión en un animal hembra que comprende determinar el nivel de CD98 en una muestra de endometrio de dicho animal, en donde dicha ventana se selecciona en el momento en que el nivel de CD98 en dicha muestra sea elevado en relación con una muestra de referencia.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un agente activador de CD98 o de CD9 para la preparación de un medicamento para aumentar la receptividad del endometrio durante la implantación del embrión.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de compuestos capaces de aumentar la receptividad del endometrio que comprende (i) poner en contacto una célula seleccionada del grupo de

a. una célula que expresa CD98 o CD9 y

b. una célula que comprende una construcción génica que comprende un polinucleótido que codifica un gen reportero en donde dicho polinucleótido se encuentra operativamente acoplado al promotor de CD98 o al promotor de CD9,

con un compuesto candidato y (ii) determinar el nivel de CD98, de CD9 o del gen reportero en dicha célula.

en donde el compuesto se considera adecuado para aumentar la receptividad del endometrio si provoca un aumento en el nivel de expresión de CD98, de CD9 o del gen reportero.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de compuestos anticonceptivos que comprende (i) poner en contacto una célula seleccionada del grupo de

a. una célula que expresa CD98 o CD9 y

b. una célula que comprende una construcción génica que comprende un polinucleótido que codifica un gen reportero en donde dicho polinucleótido se encuentra operativamente acoplado al promotor de CD98 o al promotor de CD9,

con un compuesto candidato y (ii) determinar los niveles de CD98, CD9 o del gen reportero en dicha célula en donde el compuesto se considera adecuado como compuesto anticonceptivo si provoca una disminución en el nivel de CD98, de CD9 o del gen reportero.

En un último aspecto, la invención se relaciona con un método anticonceptivo que comprende la administración a un sujeto de un inhibidor de CD98.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 describe la localización de CD98 en microdominios enriquecidos en tetraspaninas en la superficie apical de células endometriales humanas. (A) Análisis confocal de la expresión de moléculas de adhesión en cultivos de células epiteliales endometriales primarias humanas polarizadas. Las secciones verticales se obtuvieron con software confocal de Leica (LASAF) . (B) Monocapas confluentes de EEC se tiñeron doblemente para las moléculas indicadas y se analizaron mediante microscopía confocal. El análisis de la colocalización se muestra en el histograma de puntos de las intensidades de fluorescencia en ambos canales. (C) Se Usaron monocapas de EEC confluentes en tampón que contenía Brij 96 al 1% y los Usados se inmunoprecipitaron con los mAb anti-CD9 (VJ1/20) , anti-ICAM-1 (HU5/3) o anti-CD147 (VJ1/9) , o suero anti-CD98. Se incluyó Ig no inmune como control negativo. Las membranas se probaron para CD9 (VJ1/20) y CD98.

La Figura 2 describe el análisis por PCR en tiempo real de la expresión de ARNm de CD147, CD98 e ICAM-1 a lo largo del ciclo menstrual. Se distribuyeron las biopsias endometriales en cinco grupos según la fase del ciclo: grupo 1, proliferativa temprana media (días 1-8) ; grupo 2, proliferativa tardía (días 9-14) ; grupo 3, secretora temprana (días 15-18) ; grupo 4, secretora media (días 19-22) y grupo 5, secretora tardía (días 23-28) . Los datos se presentan como un valor medio relativo ± EEM de tres experimentos normalizados al valor medio de los genes de la beta-actina y GAPDH en cada fase designada el ciclo menstrual.

La Figura 3 describe la inducción de CD98 en la ventana de implantación en el endometrio humano. (A) Inmunolocalización de CD9, ICAM-1 y CD147 en endometrio humano a lo largo del ciclo menstrual. Las micrografías muestran tinciones inmunohistoquímicas representativas de muestras del grupo 4 (día 20) , correspondientes a la ventana de implantación. Las gráficas representan la expresión basada en análisis semicuantitativos de tinción a lo largo del ciclo menstrual en tres muestras endometriales por grupo. Se observa tinción fuerte para ICAM-1... [Seguir leyendo]

1. Uso de CD98 como marcador de receptividad del endometrio para la implantación del embrión.

2. Método para seleccionar la ventana temporal para la implantación del embrión en un animal hembra que comprende determinar el nivel de CD98 en una muestra de endometrio de dicho animal, en donde dicha ventana se selecciona en el momento en que el nivel de CD98 en dicha muestra sea elevado en relación con una muestra de referencia.

3. Método según la reivindicación 2 en donde la muestra de referencia es una muestra de endometrio de un animal hembra obtenida en el periodo no fértil de dicho animal.

4. Método según las reivindicaciones 2 ó 3 en donde la determinación del nivel de CD98 se determina mediante la cuantificación del ARNm que codifica CD98 o mediante la cuantificación de la proteína CD98.

5. Método según la reivindicación 4 en donde la cuantificación del ARNm que codifica CD98 se lleva a cabo mediante RT-PCR.

6. Método según la reivindicación 4 en donde la cuantificación de la proteína CD98 se lleva a cabo mediante inmunohistoquímica.

7. Uso de un agente activador de CD98 para la preparación de un medicamento para aumentar la receptividad del endometrio durante la implantación del embrión, en donde el agente activador de CD98 es un polinucleótido que codifica CD98.

8. Un método para la identificación de compuestos capaces de aumentar la receptividad del endometrio que comprende

(i) poner en contacto una célula seleccionada del grupo de

a. una célula que expresa CD98 y

b. una célula que comprende una construcción génica que comprende un polinucleótido que codifica un gen reportero en donde dicho polinucleótido se encuentra operativamente acoplado al promotor de CD98,

con un compuesto candidato y (ii) determinar el nivel de CD98º del gen reportero en dicha célula en donde el compuesto se considera adecuado para aumentar la receptividad del endometrio si provoca un aumento en el nivel de expresión de CD98 o del gen reportero.

9. Un método para la identificación de compuestos anticonceptivos que comprende (i) poner en contacto una célula seleccionada del grupo de

a. una célula que expresa CD98 y

b. una célula que comprende una construcción génica que comprende un polinucleótido que codifica un gen reportero en donde dicho polinucleótido se encuentra operativamente acoplado al promotor de CD98,

con un compuesto candidato y (ii) determinar los niveles de CD98 o del gen reportero en dicha célula en donde el compuesto se considera adecuado como compuesto anticonceptivo si provoca una disminución en el nivel de CD98 o del gen reportero.

10. Método según las reivindicaciones 8 ó 9 en donde la célula que expresa CD98 es una célula de endometrio o una línea celular de origen endometrial.

11. Método según la reivindicación 10 en donde la célula de endometrio es una célula HEC-1-A.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 en donde la determinación del nivel de CD98 se lleva a cabo mediante citometría de flujo.

13. Uso como anticonceptivo de un inhibidor de CD98 en donde el inhibidor de CD98 se selecciona del grupo de:

14. Uso según la reivindicación 13 en donde el ácido nucleico capaz de provocar el silenciamiento del ARNm que codifica CD98 es un shRNA.

15. Uso según la reivindicación 14 en donde dicho shRNA está dirigido contra una región de CD98 que comprende la secuencia SEQ ID NO:1.

16. Uso según la reivindicación 15 en donde el shRNA comprende la secuencia SEQ ID NO:2.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III Universidad Autónoma de Madrid Fundación IVI

<120> USO DE CD98 COMO MARCADOR DE RECEPTIVIDAD ENDOMETRIAL

<130> P5123ES00

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Secuencia de CD98 reconocida por el shRNA.

<400> 1

<210> 2

<211> 64

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Secuencia codificante para un shRNA específico frente a CD98

<400> 2