Un procedimiento para producir una planta transgénica de algodón,

comprendiendo dicho procedimiento:

(a) proporcionar una célula proembriogénica de algodón;

(b) cultivar la célula proembriogénica en un medio líquido para producir un cultivo de células en suspensión;

(c) proporcionar un cultivo de Agrobacterium tumefaciens que alberga un vector que comprende un gen exógeno y un marcador seleccionable, siendo el Agrobacterium capaz de efectuar la transferencia estable del gen exógeno y el marcador seleccionable al genoma de una célula vegetal, en el que el Agrobacterium tiene una virulencia pre-inducida;

(d) co-cultivar una mezcla del cultivo de la suspensión celular y el cultivo de Agrobacterium sobre un soporte sólido poroso bajo una luz continua, generando de este modo una población de células, algunas de las cuales han sido transformadas con el gen exógeno y el marcador seleccionable;

(e) seleccionar las células que expresan el gen exógeno de la población de células; y

(f) regenerar las células seleccionadas en una planta transgénica de algodón.

Procedimiento de transformación y regeneración altamente eficiente de células vegetales en suspensión Campo de la invención La presente invención se refiere en general a la ingeniería genética de plantas y, más en particular, a procedimientos de transformación mediada por Agrobacterium.

Antecedentes de la invención

En la presente solicitud, se hace referencia a varias patentes, solicitudes de patentes publicadas y publicaciones.

Las citas bibliográficas completas de las publicaciones se pueden encontrar enumeradas en la sección Bibliografía, inmediatamente antes de las reivindicaciones.

El algodón es un cultivo de importancia económica. La producción anual de fibra de algodón aporta miles de millones de dólares estadounidenses a la economía agrícola del mundo. Mientras que la transformación genética del algodón ha sido posible desde 1987 (Firoozabady y col., 1987) , los procedimientos utilizados en la actualidad siguen siendo muy ineficientes y costosos debido a las tasas inusualmente bajas de regeneración de las plantas a partir de las células transformadas y a la baja fertilidad de la flor. El proceso de regeneración prolongado añade una resistencia adicional a la eficiencia.

Varios procedimientos han estado disponibles para la transformación mediada por Agrobacterium de una variedad de explantes de algodón, tales como los cotiledones (Firoozabady y col, 1987) , los hipocótilos (Umbeck y col, 1987; patente de EE.UU. Nº 5.004.863 y 5.159.135; publicación de patente europea "EP" 0 270 355) , el pecíolo (publicación PCT WO 00/77230 A1) y la raíz (Pub. PCT. WO 00/53783) . Se han informado mejores procedimientos para la regeneración y la transformación de plantas de algodón mediante el uso de zonas de transición del hipocótilo (documento WO 98/15622) , los ápices de brotes (documento WO 89/12102 y patente de EE.UU. Nº 5.164.310) y los tejidos meristemáticos apicales o nodales (documento WO 97/43430) . Como alternativa, los explantes de algodón pueden ser transformados por medio de bombardeo de microproyectiles, por ejemplo, ejes embrionarios (documentos WO 92/15675 y EP 0 506 531; McCabe and Martinell, 1993) y cultivos embriogénicos en suspensión (Finer and Mc Mullen, 1990) .

La mayoría de los procedimientos citados anteriormente emplean una vía de regeneración de la embriogénesis somática, que requiere un largo proceso de iniciación, maduración y germinación. La transformación de tejidos somáticos de callos embriogénicos o cultivos embriogénicos en suspensión, ya sea a través de la transformación mediada por Agrobacterium (patente de EE.UU. Nº 6.483.013; patente de EE.UU. Nº 5.583.036) o el bombardeo de partículas (Finer and Mc Mullen, 1990) , ha acortado sustancialmente el proceso de regeneración. Sin embargo, la transformación sigue estando seriamente dificultada por la inusualmente baja tasa de conversión de embriones somáticos en plántulas enraizadas normales.

Aparte de la regeneración, se han buscado procedimientos más eficientes para la administración de ADN-T en el genoma del huésped en conexión con la transformación de plantas tales como el algodón. Se han llevado a cabo extensas investigaciones para comprender la virulencia de Agrobacterium y la conjugación del ADN-T. Hoy en día, es bien sabido que antes de que el ADN-T pueda ser administrado en las células vegetales, las células de Agrobacterium deben reconocer y unirse a las células huésped a través de complejos mecanismos de señalización mediados por factores químicos secretados por el huésped, cuya producción se induce a través de heridas mecánicas. Estos factores químicos consisten en una variedad de compuestos fenólicos tales como acetosiringona, ácido sinapínico (ácido 3, 5 dimetoxi-4-hidroxicinámico) , ácido siríngico (ácido 4-hidroxi-3, 5 dimetoxibenzoico) , ácido ferúlico (ácido 4-hidroxi-3-metoxicinámico) , catecol (1, 2-dihidroxibenceno) , ácido p-hidroxibenzoico (ácido 4hidroxibenzoico) , ácido º-resorcílico (ácido 2, 4 dihidroxibenzoico) , ácido protocatéquico (ácido 3, 4dihidroxibenzoico) , ácido pirrogálico (ácido 2, 3, 4-trihidroxibenzoico) , ácido gálico (ácido 3, 4, 5-trihidroxibenzoico) y vainillina (3-metoxi-4-hidroxibenzaldehído) (patente de EE.UU. Nº 6.483.013) . Se ha encontrado que una proteína virG mutante (virGN54D) expresada constitutivamente mejora la virulencia de Agrobacterium y la eficiencia de la transformación. (Hansen y col., 1994) . De manera similar, compuestos químicos, tales como acetosiringona o nopalina, que estimulan la virulencia de Agrobacterium, aumentaron notablemente la eficiencia de la transformación de ápices de algodón (Veluthambi y col., 1989) y callos somáticos embriogénicos que se propagaron en medios sólidos (patente de EE.UU. Nº 6.483.013) . Un ejemplo es la transformación con éxito de un gran número de hongos, que son incapaces de secretar compuestos inductores de virulencia de Agrobacterium, lo que hace indispensable a la acetosiringona para la conjugación del ADN-T (Bundock y col., 1995; de Groot y col., 1998) .

A pesar de los muchos esfuerzos pasados y los intentos de mejorar los procedimientos de transformación, las técnicas utilizadas hasta la fecha siguen siendo improductivas, demandan gran cantidad de tiempo y son costosas. Por consiguiente, algunas plantas, como el algodón, quedan muy rezagadas por detrás de otros cultivos importantes en la comprensión de los mecanismos moleculares del desarrollo de la planta y la diferenciación de los tejidos. Es evidente que las técnicas de transformación actuales son incompatibles con la importancia económica del algodón en particular, y hace mucho tiempo que se necesita un gran avance.

En la mayoría de las plantas, incluido el algodón, los procedimientos de transformación explotan principalmente el Agrobacterium para administrar ADN-T en las células huésped que se limitan a una pequeña superficie, es decir, la superficie de corte de los explantes o el callo (patente de EE.UU. Nº 6.483.013) . Esto limita en gran medida la incidencia de la transformación genética ya que la mayoría de las células huésped no están en contacto directo con el donador de ADN-T. Como resultado, aproximadamente sólo del 20 al 30% de los explantes se transforman (Firoozababy y col., 1987; Cousins y col., 1991) . Anteriormente, los cultivos celulares en suspensión se transformaron con éxito usando un régimen de co-cultivo que se basaba en un medio líquido en un tubo “T” o en un matraz (patente de EE.UU. Nº 5.583.036) . Si bien no se muestra ningún tipo de detalle sobre la transformación, encontramos que el procedimiento tiene una eficacia de transformación similarmente baja (Fig. 14) . Un problema importante en el procedimiento podría ser la baja eficiencia de conjugación del ADN-T cuando se realizó el co-cultivo en medio líquido rico en el que las células de Agrobacterium pueden tener dificultades para expresar los genes de virulencia y para unirse a las células vegetales mantenidas bajo agitación constante.

A diferencia de los explantes que se han utilizado principalmente para la transformación de plantas, las células en cultivos en suspensión están presentes como una sola célula o como un pequeño grupo de células. En la actualidad, no hay una técnica eficaz para manipular y transformar estos materiales. Estudios recientes han sugerido que las células de hongos cultivadas en medio líquido se pueden transformar cuando el co-cultivo se realiza en las membranas porosas colocadas sobre un medio semisólido que ha sido optimizado para la virulencia de Agrobacterium (Pub. PCT. WO 02/00896, Bundock y col., 1995; Piers y col., 1996; de Groot y col., 1998) . El uso de membranas o filtros tiene una doble ventaja. Filtra eficazmente el exceso de líquido que se hace hecho pasar, recogiendo el receptor de ADN-T y las células del donador al tiempo que permite la difusión eficiente de los nutrientes, minerales y compuestos de señalización entre el co-cultivo y el medio.

Finer (1988; patente europea 0317512 B1) inició la embriogénesis en medio líquido con bajo contenido de auxina (sales MS, vitaminas B5, 2, 4-D 0, 1 mg/l o picloram 0, 5 mg/l, sacarosa al 2%) utilizando callos indiferenciados derivados de cotiledones o explantes de hipocótilo. Los tejidos embriogénicos a continuación se hicieron proliferar o se mantuvieron en un medio líquido similar con un mayor contenido de auxina (2, 4-D 5 mg/l) . Los tejidos de la suspensión así preparados pueden convertirse en embriones maduros en medio líquido si hay glutamina presente.

Rangan y col. (patentes de EE.UU. Nº 5.583.036... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para producir una planta transgénica de algodón, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) proporcionar una célula proembriogénica de algodón;

(b) cultivar la célula proembriogénica en un medio líquido para producir un cultivo de células en suspensión;

(c) proporcionar un cultivo de Agrobacterium tumefaciens que alberga un vector que comprende un gen exógeno y un marcador seleccionable, siendo el Agrobacterium capaz de efectuar la transferencia estable del gen exógeno y el marcador seleccionable al genoma de una célula vegetal, en el que el Agrobacterium tiene una virulencia pre-inducida;

(d) co-cultivar una mezcla del cultivo de la suspensión celular y el cultivo de Agrobacterium sobre un soporte sólido poroso bajo una luz continua, generando de este modo una población de células, algunas de las cuales han sido transformadas con el gen exógeno y el marcador seleccionable;

(e) seleccionar las células que expresan el gen exógeno de la población de células; y

(f) regenerar las células seleccionadas en una planta transgénica de algodón.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la célula proembriogénica deriva de un callo.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho soporte sólido se selecciona del grupo que consiste en una membrana y un filtro.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el soporte sólido poroso comprende al menos uno de los siguientes: nylon, nitrocelulosa, celulosa y fibras de vidrio.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el algodón es un miembro seleccionado del grupo que consiste en Gossypium hirsutum y Gossypium barbadense.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el Agrobacterium es preinducido por medio del cultivo del Agrobacterium en presencia de un agente inductor de la virulencia.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el Agrobacterium es preinducido por medio del cultivo del Agrobacterium que expresa de manera constitutiva un mutante de virA activo.

8. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la célula proembriogénica de algodón se obtiene al: esterilizar una semilla de algodón; germinar la semilla de algodón para generar el tejido de la planta; obtener un explante a partir del tejido de la planta; inducir la formación de callos a partir del explante; y generar tejido proembriogénico a partir del callo.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el tejido proembriogénico se genera a partir del callo mediante la iniciación de la embriogénesis somática del callo en un medio sólido.

10. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el tejido proembriogénico se genera a partir del callo mediante la inducción de la diferenciación del callo.

11. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el tejido de la planta es una raíz o un ápice de un brote.

12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el soporte sólido está en contacto con el medio de co-cultivo por el enjuague del soporte sólido en un medio líquido de co-cultivo.

13. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el soporte sólido está en contacto con el medio de co-cultivo por estar colocado encima de un medio de co-cultivo sólido.

14. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el medio de co-cultivo de la etapa (d) comprende sales MinAB, vitaminas B5, glicerol y glucosa.

15. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el medio de co-cultivo de la etapa (d) comprende sales MS, vitaminas B5, glucosa y glicerol.

16. El procedimiento de la reivindicación 14 o 15, en el que el medio de co-cultivo está suplementado además con acetosiringona 10-200 µM.

17. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la mezcla del cultivo de la suspensión celular y el cultivo de Agrobacterium se mezclan juntos y a continuación se co-transfieren sobre el soporte sólido poroso.

18. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la mezcla del cultivo de la suspensión celular y el cultivo de Agrobacterium se co-cultivan durante 1 a 5 días bajo una luz continua.

19. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células seleccionadas se regeneran dando una planta transgénica de algodón por embriogénesis somática.