Procedimiento para controlar la acumulación de carotenoides en al menos una célula de piña,

comprendiendo el procedimiento introducir al menos un regulador de la expresión de un polipéptido de biosíntesis de carotenoide en dicha célula de piña, donde dicho regulador de la expresión de un polipéptido de biosíntesis de carotenoide inhibe la expresión de (i) una licopeno β ciclasa o (ii) una licopeno β ciclasa y una licopeno ε - ciclasa en dicha célula de piña, y donde dicho regulador de la expresión de un polipéptido de biosíntesis de carotenoide comprende (i) un segmento de ácido nucleico en una orientación sentido o antisentido con respecto a una porción de un gen endógeno que codifica a dicha licopeno ß ciclasa o (ii) un segmento de ácido nucleico en una orientación sentido o antisentido con respecto a una porción de un gen endógeno que codifica a dicha licopeno ß ciclasa, y un segmento de ácido nucleico en una orientación sentido o antisentido con respecto a una porción de un gen endógeno que codifica a dicha licopeno ε - ciclasa.

Plantas de piña transgénicas que presentan concentraciones modificadas de carotenoides y procedimiento de fabricación

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Varias frutas y verduras contienen una serie de fitoquímicos que contribuyen a la buena salud. Algunos estudios epidemiológicos, clínicos, y de laboratorio sugieren que varios carotenoides reducen la ocurrencia de enfermedades crónicas, incluyendo las enfermedades coronarias del corazón (Barton-Duell (1995) Endocrinologist, 5:347-356) , algunos cánceres (Giovannucci (1999) J. Natl. cancer Inst., 91:317-331) , y la degeneración macular debida a la edad (Seddon et al. (1994) J. Am. J. Med. Assoc., 272:1413-1420) . Así, la modulación de biosíntesis de carotenoides en plantas por manipulación genética debería afectar a la calidad nutricional de la cosecha.

Las plantas de piña (Ananas comosus de la familia Bromeliaceae) son plantas tropicales monocotiledóneas que tienen espinas rígidas con bordes curvados y hojas y tallos cortos con cabezas alargadas densas de pequeñas flores abortadas. El fruto de muchas variedades de plantas de piña se utiliza para el consumo humano. Algunas de estas variedades incluyen la Cayena Lisa, Roja Española, Perolera, Pernambuco, y Primavera. La planta es auto-incompatible, con largos períodos de tiempo entre las generaciones sucesivas de frutas. Como consecuencia, la cría convencional para mejorar la calidad de la fruta y otras características agronómicas ha resultado difícil.

De la discusión anterior, es evidente que las plantas transgénicas de piña con niveles de carotenoides modificados son deseables. En particular, las plantas de piña con niveles elevados de carotenoides en los tejidos de la fruta mejorarían la calidad nutricional de este importante cultivo. Además, las plantas de piña transformadas genéticamente con coloración alterada son deseables, entre otros, para la diferenciación del producto. Estas y una variedad de otras características de la presente invención se harán evidentes después del examen completo de la siguiente descripción.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la carotenogénesis en las plantas de piña. Más específicamente, esta invención proporciona procedimientos para la transformación genética de células y plantas de piña con reguladores de expresión que modulan la biosíntesis de carotenoides en células o plantas; en particular, la invención proporciona procedimientos para controlar la acumulación de carotenoides en las células de piña, además de procedimientos para alterar la coloración de la planta de piña, especialmente de coloración de tejidos de frutas tal como se define en las reivindicaciones. Por otra parte, la invención proporciona células de piña, que incluyen reguladores de expresión de polipéptidos de biosíntesis de carotenoides introducidos para el control de la acumulación de carotenoides en las células, y también plantas de piña que se regeneran a partir de las piñas tal como se define en las reivindicaciones.

En un aspecto, la invención se refiere a procedimientos para controlar la acumulación de carotenoides en por lo menos una célula de piña (por ejemplo, una célula embriogénica, una célula organogénica, una célula de callos embriogénicos, una célula de callo organogénica, o similares) tal como se define en las reivindicaciones. Los procedimientos incluyen la introducción de al menos un regulador de la expresión de polipéptidos de biosíntesis de carotenoides en la célula de la piña. El regulador de expresión de polipéptidos de la biosíntesis de carotenoides controla la acumulación de carotenoides en la célula de piña, aumentando o disminuyendo la acumulación de carotenoides en la célula de piña con respecto a la acumulación de carotenoides en una célula de piña que carece de reguladores de la expresión de polipéptidos de biosíntesis de carotenoides. En ciertas realizaciones, la célula de piña es una célula organogénica producida mediante el cultivo de al menos una célula meristémica (por ejemplo, una célula meristémica no apical, etc.) En algunas de estas realizaciones, el cultivo comprende cultivar la célula meristémica para producir al menos un brote, y el cultivo de al menos un explante del brote para producir la célula organogénica.

Los procedimientos para controlar la acumulación de carotenoides en la célula de al menos una piña incluyen opcionalmente además la regeneración de por lo menos una planta de la piña a partir de la célula de piña (por ejemplo, una célula embriogénica, una célula organogénica, etc.) En ciertas realizaciones, por ejemplo, la célula de piña incluye una población de células de piña y los procedimientos incluyen además: (i) la selección de uno o más miembros de la población de células de piña, que incluyen el regulador expresión de polipéptidos de biosíntesis de carotenoides, (ii) la regeneración de una o más plantas de piña a partir de los miembros, y, (iii) la selección de las plantas de piña con acumulación de carotenoides alterada con respecto a una acumulación de carotenoides en una planta de piña que carece de regulador de la expresión de polipéptidos de la biosíntesis de carotenoides. En algunas realizaciones, la acumulación de carotenoides alterada es sustancialmente específica de tejidos de la fruta de las plantas de piña. Los procedimientos también incluyen opcionalmente además micropropagar plantas de piña.

[0007]Según otro aspecto, la presente invención se refiere a procedimientos de alteración de la coloración de piña planta tal como se definen en las reivindicaciones. Los procedimientos incluyen la introducción de al menos un regulador de expresión de polipéptido de biosíntesis de carotenoides en por lo menos una planta de piña en la que el regulador de la expresión de polipéptidos de biosíntesis de carotenoides controla la acumulación de al menos un carotenoide coloreado (licopeno) en la planta de piña para alterar la coloración de la planta de piña. Es decir, el regulador de expresión de polipéptidos de biosíntesis de carotenoides aumenta la acumulación de licopeno de carotenoide coloreado de una planta de piña en relación con la acumulación de carotenoides coloreados en una planta de piña que carece de regulador de la expresión de polipéptidos de biosíntesis de carotenoides. Por lo general, los reguladores de expresión de polipéptidos de biosíntesis de carotenoides se introducen en al menos una célula de una piña a partir de la cual se regenera la planta de piña. En algunas realizaciones, la coloración alterada es sustancialmente específica de los tejidos del fruto de la planta de la piña. Opcionalmente, estos procedimientos incluyen además micropropagar la planta de la piña.

Según otro aspecto adicional, la presente invención proporciona una célula de la piña (por ejemplo, una célula embriogénica, una célula organogénica, una célula de callos embriogénicos, una célula de callo organogénica, o similares) que incluyen al menos un regulador de expresión polipéptido de biosíntesis de carotenoides introducido tal como se define en las reivindicaciones. El regulador de expresión de polipéptidos de biosíntesis de carotenoides aumenta o disminuye la acumulación de carotenoides en la célula de la piña en relación con la acumulación de carotenoides en una célula de piña que carece de regulador de expresión de polipéptidos de biosíntesis de carotenoides. La invención también proporciona una planta de piña que se regenera a partir de la célula de piña tal como se define en las reivindicaciones.

Los reguladores de la expresión de un polipéptido de biosíntesis de carotenoide de la invención son moléculas orgánicas (por ejemplo, ADN, ARN, etc) .

Los reguladores de expresión de polipéptidos de biosíntesis de carotenoides incluyen diferentes formas de realización que realizan de diversas maneras la acumulación de carotenoides en células y plantas de piña transgénicas de la presente invención. En particular, los reguladores de expresión de polipéptidos de biosíntesis de carotenoides incluyen al menos un segmento de ácido nucleico sentido o antisentido que corresponde a por lo menos una porción de al menos un gen del polipéptido de biosíntesis de carotenoides endógenos. Los segmentos de ácido nucleico de sentido y antisentido pueden utilizarse, por ejemplo, para suprimir la expresión de una enzima de biosíntesis de carotenoides seleccionada de la vía de biosíntesis de carotenoides para realizar la acumulación de carotenoides que son sustratos de la enzima suprimida.

1. Procedimiento para controlar la acumulación de carotenoides en al menos una célula de piña, comprendiendo el procedimiento introducir al menos un regulador de la expresión de un polipéptido de biosíntesis de carotenoide en dicha célula de piña, donde dicho regulador de la expresión de un polipéptido de biosíntesis de carotenoide inhibe la expresión de (i) una licopeno ciclasa o (ii) una licopeno ciclasa y una licopeno ε -ciclasa en dicha célula de piña, y donde dicho regulador de la expresión de un polipéptido de biosíntesis de carotenoide comprende (i) un segmento de ácido nucleico en una orientación sentido o antisentido con respecto a una porción de un gen endógeno que codifica a dicha licopeno ciclasa o (ii) un segmento de ácido nucleico en una orientación sentido o antisentido con respecto a una porción de un gen endógeno que codifica a dicha licopeno ciclasa, y un segmento de ácido nucleico en una orientación sentido o antisentido con respecto a una porción de un gen endógeno que codifica a dicha licopeno ε -ciclasa.

2. El procedimiento para controlar la acumulación de carotenoides en al menos una célula de piña según la reivindicación 1, donde dicho regulador de la expresión de un polipéptido de biosíntesis de carotenoide inhibe la expresión de una licopeno ciclasa y una licopeno ciclasa en dicha célula de piña, y donde dicho regulador de la expresión de un polipéptido de biosíntesis de carotenoide comprende un segmento de ácido nucleico en una orientación sentido o antisentido con respecto a una porción de un gen endógeno que codifica a dicha licopeno ciclasa, y un segmento de ácido nucleico en una orientación sentido o antisentido con respecto a una porción de un gen endógeno que codifica a dicha licopeno ε -ciclasa.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, donde dicho regulador de la expresión de un polipéptido de biosíntesis de carotenoide controla la acumulación de licopeno.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, donde dicha célula de piña es una célula organogénica producida por cultivo de al menos una célula meristemática no apicales.

5. Procedimiento para alterar la coloración de una planta de piña, comprendiendo el procedimiento introducir al menos un regulador de la expresión de un polipéptido de biosíntesis de carotenoide en al menos una planta de piña, donde dicho regulador de la expresión de un polipéptido de biosíntesis de carotenoide controla la acumulación de al menos un carotenoide coloreado en dicha planta de piña, alterando de este modo dicha coloración de dicha planta de piña, y donde dicho regulador de la expresión de un polipéptido de biosíntesis de carotenoide inhibe la expresión de (i) una licopeno ciclasa o (ii) una licopeno ciclasa y una licopeno ε -ciclasa y comprende (i) un segmento de ácido nucleico en una orientación sentido o antisentido con respecto a una porción de un gen endógeno que codifica a dicha licopeno ciclasa o (ii) un segmento de ácido nucleico en una orientación sentido o antisentido con respecto a al menos una porción de un gen endógeno que codifica a dicha licopeno ciclasa, y un segmento de ácido nucleico en una orientación sentido o antisentido con respecto a una porción de un gen endógeno que codifica a dicha licopeno ε -ciclasa.

6. El procedimiento para alterar la coloración de una planta de piña de la reivindicación 5, donde dicho regulador de la expresión de un polipéptido de biosíntesis de carotenoide inhibe la expresión de una licopeno ciclasa y una licopeno ε -ciclasa y comprende un segmento de ácido nucleico en una orientación sentido o antisentido con respecto a una porción de un gen endógeno que codifica a dicha licopeno ciclasa, y un segmento de ácido nucleico en una orientación sentido o antisentido con respecto a una porción de un gen endógeno que codifica a dicha licopeno ε -ciclasa.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, 2, 5 o la 6, donde dicha inhibición de la expresión se obtiene por interferencia del ARN.

8. El procedimiento de la reivindicación 5, donde dicho carotenoide coloreado es licopeno.

9. El procedimiento de la reivindicación 5, donde dicho regulador de la expresión de un polipéptido de biosíntesis de carotenoide se introduce en al menos una célula de piña a partir de la cual dicha planta de piña se regenera.

10. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde dicho regulador de la expresión de un polipéptido de biosíntesis de carotenoide controla la acumulación de carotenoide en dicha célula de piña mediante el aumento de la acumulación de licopeno.

11. Célula de piña que comprende al menos un regulador de la expresión de un polipéptido de biosíntesis de carotenoide heterólogo, inhibiendo dicho regulador de la expresión de un polipéptido de biosíntesis de carotenoide la expresión de (i) una licopeno ciclasa o (ii) una licopeno ciclasa y una licopeno ε -ciclasa en dicha célula de piña, y comprende (i) un segmento de ácido nucleico en una orientación sentido o antisentido con respecto a una porción de un gen endógeno que codifica a dicha licopeno ciclasa o (ii) un segmento de ácido nucleico en una orientación sentido o antisentido con respecto a una porción de un gen endógeno que codifica a dicha licopeno

ciclasa, y un segmento de ácido nucleico en una orientación sentido o antisentido con respecto a una porción de un gen endógeno que codifica a dicha licopeno ε -ciclasa.

12. Célula de piña según la reivindicación 11, donde dicho regulador de la expresión de un polipéptido de biosíntesis de carotenoide inhibe la expresión de una licopeno ciclasa y una licopeno ε -ciclasa en dicha célula

de piña, y comprende un segmento de ácido nucleico en una orientación sentido o antisentido con respecto a una porción de un gen endógeno que codifica a dicha licopeno ciclasa, y un segmento de ácido nucleico en una orientación sentido o antisentido con respecto a una porción de un gen endógeno que codifica a dicha licopeno ε ciclasa.

13. Célula de piña según la reivindicación 12, donde dicha inhibición de la expresión se obtiene por interferencia 10 del ARN.

14. Célula de piña según la reivindicación 11, donde dicho regulador de la expresión de un polipéptido de biosíntesis de carotenoide controla la acumulación de licopeno.

15. Planta de piña regenerada a partir de dicha célula de piña según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.