Sistema de transposición de transposon Mboumar.

Sistema de transposición que comprende un péptido obtenido de Messor bouviri de forma recombinante y sus usos,

incluyendo un método para la generación de transgénesis y mutagénesis aleatoria en el genoma de células procariotas o eucariotas.

Sistema de transposición del transposón Mboumar.

La presente invención se incluye en el área de biología molecular, concretamente dentro de la genética molecular, y más concretamente en el campo de estudio de los elementos genéticos móviles o transposones. Se refiere a sistema para transponer una secuencia de DNA o polinucleótido que comprende un péptido recombinante obtenido de Messor bouvieri y una construcción genética con las regiones ITR que reconoce dicho péptido, y a sus usos, incluyendo un método para la generación de transgénesis y mutagénesis aleatoria en el genoma de células procariotas o eucariotas.

Estado de la técnica anterior Los transposones son secuencias de ADN que pueden moverse a diferentes posiciones dentro del genoma de una célula, un proceso denominado transposición. En general se clasifican en dos grupos:

- Transposones de Clase I o retrotransposones, inicialmente los retrotransposones se copian a sí mismos a ARN (transcripción) pero, además de transcribirse, el ARN se copia en el ADN por una transcriptasa inversa (a menudo codificada también por el transposón) e insertada de nuevo en el genoma.

- Transposones de Clase II, cuyo mecanismo de transposición no implica la formación de RNA. Generalmente se transponen por un proceso de "cortar y pegar", mediante una enzima transposasa.

Las transposasas son las enzimas responsables de su movilidad y son sintetizadas por el propio transposón. In vivo pueden originar transposición de material genético dentro de un mismo cromosoma, entre cromosomas, e incluso entre cromosomas y material genético no cromosómico como, por ejemplo, ADN mitocondrial. Este movimiento de material genético puede originar graves disturbios en el organismo en que se produce, aunque también se sabe que ha tenido una gran importancia a lo largo de la evolución. En un principio los transposones se consideraron como "ADN basura". Sin embargo, actualmente se piensa que pueden influir en el genoma hospedador de diferentes maneras. Así, se considera que pueden modular la expresión génica actuando como promotores, activadores, silenciadores, sitios de procesamiento alternativo o sitios indicativos de modificaciones epigenéticas. Igualmente, pueden contener genes que podrían ser incluidos en el genoma del huésped para la realización de una función celular determinada, proceso que se conoce como "domesticación molecular". Además de todo lo anterior, debido a su existencia en copias múltiples pueden actuar como sitios de recombinación originando en el genoma duplicaciones, inversiones, deleciones o translocaciones. (Charlesworth et al. 1994. The evolutionar y dynamics of repetitive DNA in eukar y otes. Nature 371: 215-220; Kidwell MG. 2002. Transposable elements and the evolution of genome size in eukar y otes. Genetica 115: 49-63; Ivics & Izsvak 2004. Transposable elements for transgenesis and insertional mutagenesis in vertebrates: a contemporar y review of experimental strategies. Methods Mol Biol 260: 255-276) . Recientes observaciones demuestran que los transposones pueden ser activos en células somáticas, abriendo la posibilidad de que puedan jugar un importante papel generando diversidad entre células con un mismo genoma. Concretamente, se ha considerado que esta diversidad podría ser generada por cambios en la regulación de la expresión de la transposasa que a su vez, podría afectar la regulación de la expresión génica de ciertos genes en determinadas células. Los efectos podrían ser beneficiosos (como ocurre probablemente en los casos de diferenciación de células neuronales, o en la actividad de las proteínas RAG, importantes en los procesos de recombinación que ocurren en el genoma de los linfocitos) o deletéreos (procesos cancerígenos) dependiendo del momento del desarrollo y del tipo celular (Collier and Largaespada. Transposable elements and the dynamic somatic genome. Rewied. 2007. Genome Biology 2007, 8 (Suppl 1: S5) .

Los transposones del tipo mariner son secuencias capaces de moverse por el genoma que se encuentran flanqueadas por secuencias repetidas terminales invertidas (inverted terminal repeats ó ITRs) . Codifican una única proteína, la transposasa, que uniéndose a esas ITRs escinde el mariner y lo integra en otro lugar del genoma. La transposasa Mos1 cataliza el movimiento del transposón Mos1 encontrado en Drosophila mauritania, el cual es, no sólo el primer elemento mariner aislado, sino también el primer elemento mariner aislado activo de forma natural. Los elementos mariner constituyen una numerosa familia de transposones ampliamente extendidos en el reino animal. Codifican la enzima transposasa que es el único requerimiento para su transposición. Esta enzima tiene dos dominios: el dominio N-terminal o dominio de unión al DNA y el dominio C-terminal o dominio catalítico, el cual conserva el motivo DD (34) D. En esta enzima se han identificado además otros motivos y dominios imprescindibles para su actuación. A pesar de lo mencionado, aún hay aspectos desconocidos de su actuación, cuyo conocimiento podría proporcionar grandes ventajas para su uso como vectores, además de proporcionar interesantes datos científicos; por este motivo en los últimos años se están realizando numerosos estudios en este sentido.

La amplia distribución de los elementos mariner, presentes también en humanos, y su, aparentemente, fácil transferencia horizontal entre distintos grupos de animales, implica que son capaces de funcionar en diferentes ambientes celulares, es decir, no requieren factores específicos del hospedador para llevar a cabo su transposición. Estos hechos han llevado a la realización de una serie de estudios para conseguir un vector de amplio uso en células animales. Sin embargo, la mayor parte de los elementos mariner que se han clonado hasta el momento son defectivos, ya que han sufrido mutaciones en la región codificante de la transposasa, por lo que son incapaces de producir transposasas funcionales, motivo que ha originado que los transposones usados actualmente como vectores sean mayoritariamente derivados de construcciones realizadas en el laboratorio, usando secuencias consenso. Esto parece deberse a un proceso denominado "inactivación vertical" (Lohe et al., 1995. Horizontal transmission, vertical inactivation, and stochastic loss of mariner-like transposable elements. Mol. Biol. Evol. 12: 62 72) . Aunque estos elementos son inactivos de forma natural (al menos respecto su función transposasa) , conservan relativamente su estructura, existiendo varias hipótesis al respecto. Así, puede que los elementos inactivos tengan algún efecto regulatorio, o que provengan de la introgresión reciente de un genoma a otro.

La importancia del uso de vectores basados en transposones en campos tan diversos como el estudio de genes implicados en el cáncer, en la generación de modelos de enfermedades humanas en ratón, en la generación de cerdos transgénicos con posibilidad de utilización como granjas farmacéuticas, en la regulación génica y diferenciación celular, en estudios de genómica funcional etc., ha llevado a la realización de numerosas investigaciones con estos vectores utilizados en diferentes organismos y en diferentes condiciones.

Se han desarrollado herramientas de transposición in vivo en varios organismos. (En la tabla 1 se expone un resumen) . En la mayoría de los casos, hospedadores específicos requerían vectores especiales.

Las reacciones de transposición in vivo se llevan a cabo con independencia de las condiciones celulares o del hospedador: Generalmente se llevan a cabo con transposasas purificadas, y como dianas se pueden emplear plásmidos, fragmentos génicos, o ADN genómico aislado. En reacciones sucesivas, los plásmidos que contienen los transposones pueden ser transferidos a células hospedadoras.

La transposición in vitro ofrece muchas ventajas sobre los sistemas in vivo (Devine and Boeke 1994. Efficient integration of artificial transposons into plasmid targets in vitro: a useful tool for DNA mapping, sequencing and genetic analysis. Nucleic Acids Res, 22: 3765-3772; Bier y et al. 2000. A simple in vitro Tn7-based transposition system with low target site selectivity for genome and gene analysis. Nucleic Acids Res, 28: 1067-1077) , principalmente se puede evitar la interferencia con factores del hospedador. Las reacciones de transposición in vitro son, generalmente, más eficientes y más flexibles en la elección de las dianas en el ADN (Gor y shin and Reznikoff. 1998. Tn5 in vitro transposition. J Biol Chem, 273: 7367-7374) . En la tabla 2 se resumen las distintas aplicaciones de los transposones, tanto in vitro como in vivo.

Los... [Seguir leyendo]

1. Un sistema para transponer una secuencia de DNA o polinucleótido que comprende:

a. Un péptido recombinante cuya secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, o una construcción genética que permita la expresión de dicho péptido recombinante,

b. Una construcción genética que comprende el polinucleótido para transponer insertado entre las regiones ITR reconocidas por el péptido recombinante según (a) .

c. Una molécula de ADN receptora a la que se puede transponer la secuencia de DNA o polinucleótido insertado entre las regiones ITR según (b) .

2. El sistema para transponer una secuencia de DNA o polinucleótido según la reivindicación anterior, donde las secuencias ITR son la SEQ ID NO:2ylaSEQ ID NO: 3.

3. El sistema para transponer una secuencia de DNA o polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 12, donde la secuencia de aminoácidos del péptido recombinante de (a) presenta, al menos, una identidad del 70% con la SEQ ID NO: 1.

4. El sistema para transponer una secuencia de DNA o polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 13, donde la secuencia de aminoácidos del péptido recombinante de (a) presenta, al menos, una identidad del 80% con la SEQ ID NO: 1

5. El sistema para transponer una secuencia de DNA o polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 14, donde la secuencia de aminoácidos del péptido recombinante de (a) presenta, al menos, una identidad del 90% con la SEQ ID NO: 1.

6. El sistema para transponer una secuencia de DNA o polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 15, donde la secuencia de aminoácidos del péptido recombinante de (a) presenta, al menos, una identidad del 95% con la SEQ ID NO: 1.

7. El sistema para transponer una secuencia de DNA o polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 16, donde la secuencia de aminoácidos del péptido recombinante de (a) es la SEQ ID NO: 1

8. Uso del sistema para transponer una secuencia de DNA o polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para la generación de mutaciones aleatorias.

9. Uso del sistema para transponer una secuencia de DNA o polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para la generación de transgénesis y mutagénesis aleatoria en el genoma de células procariotas o eucariotas.

10. Uso del sistema para transponer una secuencia de DNA o polinucleótido según la reivindicación 9, donde la transgénesis o la mutagénesis aleatoria se realiza in vitro.

11. Un método para la transposición in vitro que comprende poner en contacto el péptido recombinante según el apartado (a) de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, con la construcción genética según el apartado (b) de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

12. Un método según la reivindicación 11, para la generación de transgénesis y mutagénesis aleatoria en el genoma de células procariotas o eucariotas.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> UNIVERSIDAD DE JAÉN

<120> Sistema de transposición del transposón Mboumar <130> ES1881.8

<150> P200800593

<151>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 345

<212> PRT

<213> Messor bouvieri <400> 1 <210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> región ITR

<400> 2

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> región ITR

<400> 3