Semillas.

Un procedimiento para modificar proliferación celular en los integumentos y/o revestimientos de semilla de unaplanta que comprende modular la expresión del gen mnt en la planta o material de propagación de planta.

Semillas

Campo de la invención

La presente invención se refiere particularmente, aunque no exclusivamente, a procedimientos para modificar características tales como tamaño de semillas en plantas, especialmente plantas con flor, y a plantas y material de planta reproducible producido por los procedimientos. La invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico para su uso en tales procedimientos, así como a plantas modificadas y material de planta reproducible en sí mismo.

Antecedentes de la invención

La industria de las semillas puede dividirse en dos sectores comerciales de alto valor: semillas para cultivos de campo tales como maíz, semillas de aceite, remolacha azucarera y cereales, y semillas para verduras y flores. La mejora científica de plantas de cultivo ha pasado por una sucesión de innovaciones que conducen al desarrollo de variedades híbridas de muchos cultivos y, más recientemente, a la introducción de cultivos genéticamente mejorados. El mercado de las semillas comerciales a nivel mundial se valora en aproximadamente 30.000 millones de dólares (Federación Internacional de Semillas) .

1. Importancia del tamaño de las semillas

El rendimiento en plantas de cultivo en las que la semilla es el producto cosechado se define habitualmente como peso de semilla cosechada por unidad de área (Duvick, 1992) . En consecuencia, el peso de las semillas individuales se considera un determinante principal del rendimiento. El aumento del tamaño de semillas es deseable debido a que puede aumentar el rendimiento total (Reynolds y col., 2001) . También hay pruebas de que el tamaño de semillas (peso) se correlaciona positivamente con varios componentes de la “calidad de las semillas” tales como el porcentaje de germinación (Schaal, 1980; Alexander y Wulff, 1985; Guberac y col, 1998) ; tiempo hasta la aparición (Winn, 1985; Wulff, 1986) ; durabilidad (supervivencia en condiciones de crecimiento adversas) (Krannitz y col, 1991; Manga y Yadav, 1995) ; y tasa de crecimiento (Marshall, 1986) . La calidad de la semilla es un factor importante en el coste de producción de lotes de semillas comerciales puesto que estas deben ensayarse antes de su venta. En consecuencia, el aumento del peso de semilla total, incluso sin aumentos de rendimientos de semillas totales, puede tener beneficios económicos a través de mejoras en la calidad de la semilla. Por el contrario, la reducción del tamaño de las semillas también puede ser deseable en algunas circunstancias, por ejemplo facilitando la captación de agua requerida para germinación (Harper y col., 1970) , o en plantas cultivadas por su fruto.

La modificación del tamaño de las semillas probablemente también mejore el rendimiento a través del aumento del “potencial de sumidero” de la semilla (es decir su capacidad para requerir nutrientes del parental de semilla) , o el aumento del periodo en el que la semilla actúa como un sumidero fuerte. Está bien establecido que los requisitos de órganos sumidero tales como semillas tienen un control significativo sobre la tasa de fotosíntesis y el movimiento de los fotoasimilados desde la fuente a los tejidos sumidero (Patrick y Offler, 1995; Paul y Foyer, 2001) . En el trigo, el parental de semilla puede proporcionar más nutrientes de lo que son capaces de requerir las semillas en desarrollo durante los primeros 15-20 días después de la polinización (Austin, 1980) . Por lo tanto modificaciones que permitan a las semillas extraer nutrientes más temprano en el desarrollo, por ejemplo acelerando el crecimiento de las semillas, permitirá que las semillas capturen recursos que de otro modo se perderían. También se ha propuesto un “equilibrio de fuente-sumidero mejorado que permita requisitos de sumidero más altos durante engrosamiento del grano” como un procedimiento para aumentar el rendimiento en trigo (Reynolds y col., 2001) .

2. Composición de semillas

Las semillas maduras de plantas con flor consisten en tres componentes: el revestimiento de la semilla, que es de origen exclusivamente materno; y los dos productos de fertilización, embrión y endospermo, que tienen contribuciones genéticas maternas y paternas. Las semillas se desarrollan a partir de óvulos fertilizados. El desarrollo de los óvulos se ha descrito para muchas especies (Bouman, 1984) , incluyendo Arabidopsis thaliana (Robinson-Beers y col., 1992; Schneitz y col., 1995) . Las estructuras principales del óvulo maduro son: el saco embrionario, que contiene las células reproductoras femeninas (ovocito y célula central) ; la nucela, que rodea el saco embrionario al menos parcialmente; y los integumentos interior y exterior, que envuelven el saco embrionario y la nucela. Después de fertilización el embrión y el endospermo nutritivo se desarrollan dentro del saco embrionario mientras que los integumentos se diferencian al revestimiento de la semilla, que se expande para acomodar el endospermo y el embrión crecientes.

La mayoría de las plantas monocotiledóneas, por ejemplo cereales incluyendo maíz, trigo, arroz y cebada (véase Esau, 1965) , producen semillas albuminosas, es decir, en la madurez contienen un embrión pequeño y un endospermo relativamente grande. La mayoría de las plantas dicotiledóneas, por ejemplo Brassica napus, (colza) , soja, cacahuete, Phaseolus vulgaris (por ejemplo alubia, judía blanca, frijol negro) , Vicia faba (haba) , Pisum sativum (guisante) , Cicer aeietinum (garbanzo) y Lens culinaris (lenteja) , producen semillas exalbuminosas, es decir, las semillas maduras carecen de endospermo. En tales semillas el embrión es grande y generalmente llena la mayor

parte del volumen de la semilla, y representa el peso casi completo de la semilla. En semillas exalbuminosas el endospermo es de naturaleza efímera y alcanza la madurez cuando el embrión es pequeño y altamente inmaduro (habitualmente etapa corazón/torpedo) . El desarrollo embrionario habitualmente depende de la presencia del endospermo, que en general se acepta que actúa como una fuente de nutrición para el embrión.

3. Control del tamaño de las semillas

El control de tamaño de las semillas puede verse desde la perspectiva de (1) “desarrollo”, el alcance de la división y expansión celular en uno o más componentes de semilla (por ejemplo Reddy y Daynard, 1983; Swank y col, 1987; Scott y col., 1998; Garcia y col., 2003) o (2) “metabolismo”, actividad metabólica y transporte de nutrientes dentro de la semilla y entre la semilla y el parental de semilla (por ejemplo Weber y col., 1996, 1997) . El desarrollo y el metabolismo son interdependientes: por ejemplo, la actividad invertasa (implicada en el transporte de hexosa) en el límite de los tejidos maternos y endospermo o saco embrionario se requiere para proliferación de endospermo en maíz (Cheng y col., 1996) , y la alta actividad invertasa se correlaciona con aumento del número de células en el revestimiento de semilla de habas (Weber y col., 1996) , embriones de leguminosas (Weber y col., 1997) y endospermo de cebada (Weschke y col., 2003) . Las presentes investigaciones de los inventores se centran en los aspectos del desarrollo de control de tamaño de las semillas, aunque puede asumirse que también se correlacionarán cambios en la división celular/expansión en la semilla con cambios en la actividad metabólica y el flujo de nutrientes.

3a. Crecimiento de semillas conducido por endospermo

Varios estudios muestran una correlación entre el crecimiento del endospermo y el tamaño final de las semillas, por ejemplo en maíz (Lin, 1984; Jones y col., 1996) , e incluso en la dicotiledónea Arabidopsis thaliana, que tiene un endospermo efímero (Scott y col., 1998; Garcia y col., 2003) . El trabajo en el laboratorio de los inventores ha mostrado que la sobreproliferación del endospermo conduce a semillas grandes con embriones grandes, mientras que la inhibición de la proliferación del endospermo produce semillas pequeñas con embriones pequeños. Los inventores han manipulado la proliferación del endospermo y el tamaño de las semillas usando una diversidad de procedimientos, incluyendo modificaciones de la relación de cromosomas heredados paternos y maternos en el endospermo, estado de metilación de citosina de los parentales que contribuyen a la semilla y uso de la mutación fis3/fie (Scott y col., 1998; Adams y col., 2000; Vinkenoog y col., 2000) . En estos experimentos los inventores han considerado que los cambios resultantes del crecimiento de las semillas están “conducidos... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para modificar proliferación celular en los integumentos y/o revestimientos de semilla de una planta que comprende modular la expresión del gen mnt en la planta o material de propagación de planta.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el tamaño global en los integumentos/revestimiento de semilla en la planta se modifica.

3. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2 en el que la expresión de mnt se inhibe.

4. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación 1 a 3 en el que la división celular en los integumentos/revestimiento de semilla aumenta dando como resultado una semilla mayor en comparación con tipo silvestre.

5. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que la semilla es al menos 5% más pesada que el tipo silvestre.

6. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que el diámetro del tallo de la planta modificada o transformada es al menos 10% mayor que el tipo silvestre.

7. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que la longitud de los sépalos de la planta es suficientemente mayor que el tipo silvestre para inhibir la apertura de la flor.

8. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que el número de células en los integumentos/revestimiento de semilla de la planta aumenta en comparación con el tipo silvestre.

9. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 en el que la expresión de mnt está potenciada.

10. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en el que la expresión del gen mnt se modula transformando la planta o material de propagación de planta con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia reguladora.

11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la secuencia reguladora incluye un promotor.

12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el promotor es el promotor del gen INO o BEL1, el promotor 35S o un promotor del gen BAN TT1, TT2, TT8, TT12 o TT16.

13. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 en el que la secuencia de ácido nucleico comprende o deriva de MNT de tipo silvestre o una forma mutante de mnt.

14. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la planta se ha modificado para mantener su fertilidad.

15. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la función de MNT de tipo silvestre se restaura a pétalos y estambres de la planta o una planta mutante mnt de modo que las semillas tengan un fenotipo modificado pero de modo que la fertilidad no se altere.