SECUENCIA EXPRESABLE SOLUBLE Y ESTRUCTURA CRISTALOGRÁFICA DEL DOMINIO NUCLEASA DE LA SUBUNIDAD TERMINASA UL89 DEL CITOMEGALOVIRUS HUMANO.
Secuencia expresable soluble y estructura cristalográfica del dominio nucleasa de la subunidad termisasa UL89 del citomegalovirus humano.
La invención se refiere al péptido correspondiente a la proteína UL89-C, a la forma cristalina de dicho péptido, y al uso de los mismos para el screening y/o diseño de drogas antivirales para el tratamiento de infecciones causadas por herpesvirus. En la presente invención se muestra la generación de un péptido soluble que comprende la región C-terminal de la proteína UL89 (UL89-C) del citomegalovirus humano. Este péptido mantiene la actividad nucleasa de la proteína UL89 completa, presentando una elevada solubilidad, lo que permite realizar con mayor facilidad estudios de actividad, presentando así una gran aplicabilidad a la hora de buscar fármacos útiles para el tratamiento frente a infecciones producidas por herpesvirus.
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200931195.
Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC).
Nacionalidad solicitante: España.
Inventor/es: COLL CAPELLA,MIQUEL, SOLA VILLARRUBIAS,MARIA, NADAL ROVIRA,MARTA.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K14/045 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Citomegalovirus.
- C12Q1/25 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen enzimas que no pueden ser clasificarsse en los grupos C12Q 1/26 - C12Q 1/70.
PDF original: ES-2362231_A1.pdf
Fragmento de la descripción:
Secuencia expresable soluble y estructura cristalográfica del dominio nucleasa de la subunidad terminasa UL89 del citomegalovirus humano.
La presente invención se refiere al péptido correspondiente a la proteína UL89-C, a la forma cristalina de dicho péptido, y al uso de los mismos para el screening y/o diseño de drogas antivirales para el tratamiento de infecciones causadas por herpesvirus.
Estado de la técnica anterior
Las infecciones víricas son uno de los mayores problemas que se presentan en los individuos inmunodeficientes, como son por ejemplo los pacientes de SIDA o los neonatos. Dentro de estas infecciones, una de las de mayor relevancia a nivel mundial es la infección por citomegalovirus.
El citomegalovirus humano (HCMV ó HHV5) es un virus perteneciente a la familia Herpesviridae, subfamilia Betaherpesviridae que da lugar a la infección congénita de mayor incidencia en los países industrializados. La familia de los herpesvirus incluye, además del citomegalovirus, gran variedad de virus patógenos humanos como por ejemplo, herpes simplex tipo 1 y 2 (HSV-1 o HHV-1 y HSV-2 o HHV-2), varicella zóster (VZV o HHV-3), Epstein-Barr (EBV o HHV-4), roseolovirus (HHV-6 y HHV-7) o herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi (KSHV o HHV-8). Todos los herpesvirus presentan unas características comunes como por ejemplo, presentar como material genético ADN bicatenario o tener la capacidad de mantenerse en estado latente en su hospedador natural.
En la actualidad el tratamiento se realiza fundamentalmente mediante inhibidores de ADN polimerasas, aunque este método de tratamiento ha de ser mejorado ya que los fármacos implicados presentan una elevada inespecificidad, y al ser de administración sistémica, provocan efectos secundarios. Los fármacos utilizados en este sentido son, por ejemplo, ganciclovir, valaciclovir, cidofovir o foscarnet (Griffiths 2002. J Antimicrob Chemother, 49:243-253). Sin embargo, la mayoría de estos compuestos no ofrecen una buena biodisponibilidad, haciendo necesaria la administración de gran cantidad de ellos. Esto provoca su acumulación en diversos órganos del individuo, lo que potencia los efectos adversos de los compuestos sobre dichos tejidos. Además, al ser tratamientos crónicos, se acaba produciendo la selección de cepas del virus resistentes a los mismos (Scott et al. 2005. J Gen Virol., 86: 2141-2151). Esto hace necesaria la búsqueda de nuevos fármacos y dianas que sean útiles para el control y eliminación de infecciones producidas por citomegalovirus. Un ejemplo de nueva diana identificada para tratar de minimizar los efectos nocivos del virus es la proteína-kinasa UL97, necesaria para el desarrollo de la infección viral (Andrei et al. 2009. Infect Disord Drug Targets; 9:201-222).
En estos organismos la replicación del ADN se lleva a cabo en el núcleo de las células hospedadoras. La replicación da lugar a una única molécula de ADN la cual presenta múltiples copias del material genético del virus. Es necesario escindir los concatémeros formados para dar lugar a múltiples moléculas individualizadas, cada una de las cuales representa una única copia completa del material genético. Estas moléculas independientes son las que acaban siendo encapsidadas dando lugar al organismo maduro. Este mecanismo de replicación y encapsidación se encuentra bastante conservado en la evolución de los virus, por lo que las proteínas implicadas en este proceso presentan homologías entre los distintos miembros de la familia de los herpesvirus.
Una de las enzimas más importantes implicadas en este proceso es el complejo terminasa. Este complejo, en el citomegalovirus humano, se encuentra formado por, al menos, 2 subunidades (UL56 y UL89) las cuales presentan diferentes funcionalidades. La función del complejo dentro del proceso de encapsidación, es la de realizar la separación de los concatémeros de la molécula de ADN formada por la replicación continua del ADN del virus. Para este proceso, resulta fundamental la participación de la subunidad UL89, ya que presenta actividad tanto nucleasa como ATPasa, y puede, de forma independiente, unirse y digerir ADN en fragmentos más pequeños.
La proteína UL89 se encuentra codificada por el gen ul89, formado por 2 exones y un intrón, y da lugar a una proteína de 674 aminoácidos. Esta proteína UL89 presenta subunidades homologas en el complejo terminasa de otros herpesvirus como puede ser, por ejemplo, en el complejo terminasa del virus herpes simplex 1 (HSV-1). También conserva una alta homología con la subunidad mayor del complejo terminasa de algunos bacteriófagos como por ejemplo el bacteriófago T4. Esto se debe a la alta conservación del mecanismo de encapsidación que presentan estos organismos.
Al ser una subunidad proteica tan conservada en la evolución de los virus, y encontrarse elementos homólogos en todos los herpesvirus, se convierte en un candidato ideal para ser una diana sobre la que desarrollar fármacos que permitan el tratamiento de infecciones por estos organismos. Además, presenta la ventaja de que se encuentra únicamente en células infectadas donde se da la replicación del virus, y en ningún caso en células eucarióticas no infectadas, lo que reduce los posibles efectos nocivos de los compuestos dirigidos a su inactivación en los tejidos de los individuos tratados. De esta forma, mediante tratamientos dirigidos a esta proteína, se podría evitar la producción de nuevos viriones por el bloqueo del complejo de terminación, evitando daños secundarios en las células eucarióticas del organismo hospedador.
La dificultad, en la actualidad, se encuentra en el manejo de los complejos terminasa o de la proteína UL89 de forma independiente, ya que no se expresan de forma soluble y por ello resulta complicada la experimentación sobre las mismas. La falta de solubilidad de estas moléculas hace más difícil, el estudio en sí de las mismas, así como la realización de ensayos de interacción de las terminasas con diversos compuestos químicos para estudios de actividad enzimática.
Para una correcta caracterización de las terminasas, y un completo estudio de su potencial como dianas, se hace necesario el conocimiento de su estructura tridimensional. Para esta caracterización estructural se han tratado de desarrollar diversas aproximaciones como el estudio tanto de la estructura primaria como de la secundaria de la proteína, además de su comparación con estructuras conocidas para poder obtener una idea de la conformación estructural de la misma en su forma nativa (Champier et al. 2007 Antivir Ther., 12:217-232). Sin embargo, para llevar a cabo una caracterización correcta y precisa, a alta resolución, de la estructura tridimensional de la proteína, es necesario su estudio por cristalografía de rayos X o por resonancia magnética nuclear (RMN).
Para llevar a cabo la cristalización o el análisis por RMN, es necesario tener una cantidad mínima de proteína en forma soluble. A veces no resulta posible el aislamiento de suficiente cantidad de proteína de forma soluble debido, por ejemplo, a la baja cantidad presente en el organismo, la inestabilidad de la misma durante su purificación o su baja solubilidad. Una forma de tratar de solucionar estos problemas es la clonación del gen en organismos procariotas, u otros sistemas, para tratar de aumentar su expresión. Aun así, a veces no se aumenta de forma significativa la expresión, se producen proteínas con defectos en el plegamiento o se da agregación proteica. Para tratar de solventar estos problemas, se intentan co-expresar chaperonas con las proteínas de interés. También se usan sistemas eucariotas que permitan un procesamiento post-traduccional. Sin embargo, mediante todos estos sistemas no se ha conseguido obtener suficiente cantidad de proteína UL89 para su cristalización o análisis por RMN y su uso en ensayos de interacción y actividad. Por ello son necesarias nuevas aproximaciones para la solución de este problema.
Por otro lado, para tratar de estudiar las proteínas que presentan una baja solubilidad, se está implementando la creación de bibliotecas de fragmentos del gen que codifique para la proteína de interés, la expresión de dichos fragmentos y su análisis para obtener fragmentos de la proteína que tengan mejorada la solubilidad y permitan el estudio global de la proteína. Una de estas técnicas, es la técnica de ESPRIT (Expression of Soluble Protein-domains by Random Incremental Truncation) (Fogg et al. 2008. Biochem Soc Trans; 36:771-775).... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Péptido aislado y purificado que consiste en una región de la proteína UL-89, empezando en uno de los aminoácidos 415 a 421 y terminando en uno de los aminoácidos 669 a 674 de la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1.
2. Péptido según la reivindicación 1 que empieza en el aminoácido 418 y termina en el aminoácido 674 de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2.
3. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 en forma cristalina.
4. Péptido según la reivindicación 3 perteneciendo al sistema ortorrómbico.
5. Péptido según la reivindicación 4 donde el sistema ortorrómbico es de celda primitiva.
6. Péptido según la reivindicación 5 donde la celda primitiva pertenece al grupo espacial P212121.
7. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 cuyas dimensiones de celda unidad se encuentran en un rango de: a entre 80 y 85 Å, b entre 85 y 90 Å, c entre 180 y 200 Å.
8. Péptido según la reivindicación 7 donde las dimensiones de celda unidad son: a=82,6 Å, b=87,9 Å, c=189,4 Å.
9. Péptido según la reivindicación 7 donde las dimensiones de celda unidad son: a=82,9 Å, b=88,0 Å, c=188,3 Å.
10. Péptido según la reivindicación 7 donde las dimensiones de celda unidad son: a=83,7 Å, b=88,1 Å, c=190,7 Å.
11. Péptido según la reivindicación 7 donde las dimensiones de celda unidad son: a=83,1 Å, b=87,7 Å, c=198,4 Å.
12. Péptido según la reivindicación 7 donde las dimensiones de celda unidad son: a=82,8 Å, b=87,8 Å, c=198,3 Å.
13. Péptido según la reivindicación 7 donde las dimensiones de celda unidad son: a=81,8 Å, b=87,7 Å, c=185,4 Å.
14. Uso del péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para el screening y/o diseño de compuestos inhibidores de la terminasa de los herpesvirus.
15. Uso del péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para el screening y/o diseño de compuestos útiles en la elaboración de medicamentos para el tratamiento de infecciones provocadas por herpesvirus.
16. Uso del péptido según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15 donde el herpesvirus se selecciona de la lista que comprende: virus del herpes simplex 1, virus del herpes simplex 2, varicella zóster, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus, roseolovirus, o virus asociado al sarcoma de Kaposi.
17. Uso del péptido según la reivindicación 16 donde el herpesvirus es el citomegalovirus humano.
18. Método de screening de compuestos inhibidores de la actividad de UL89-C del citomegalovirus que comprende:
19. Método de diseño de fármacos o inhibidores de la actividad de UL89-C del citomegalovirus que comprende:
20. Método de diseño de fármacos o inhibidores de la actividad de UL89-C del citomegalovirus que comprende:
21. Método de diseño de fármacos o inhibidores de la actividad de UL89-C del citomegalovirus que comprende:
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