RESISTENCIA A INSECTOS USANDO INHIBICIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA.

Resistencia a insectos usando inhibición de la expresión génica Introducción Actualmente existen varios enfoques para obtener plantas con mayor resistencia a plagas de insectos de plantas. Sin embargo, para insectos chupadores de savia de las plantas, tales como áfidos, saltadores de plantas, pentatomoideas, y moscas blancas, actualmente sólo hay opciones limitadas para proteger plantas usando enfoques transgénicos. No se ha demostrado que las plantas que expresan las toxinas de Bacillus thuringiensis dirigidas a insectos lepidópteros poseen mayor resistencia frente a insectos chupadores de savia de las plantas (Rao et al., 1998). La tecnología de dsRNA ha demostrado ser muy específica y muy efectiva silenciando genes endógenos en varios organismos. Sin embargo, el dsRNA proporcionado hasta la fecha está empaquetado típicamente en una célula bacteriana o de levadura, o en agentes que promueven la transfección, tales como liposomas. En esta invención, ahora se ha demostrado que el dsRNA desnudo, sin empaquetar, se puede usar para silenciar genes e insectos chupadores de savia de las plantas. Los insectos chupadores de savia de las plantas se alimentan típicamente de la savia en el sistema vascular de las plantas, con la que entran en contacto con los estiletes de su probóscide, provocando una reducción en la vitalidad de la planta y la diseminación de varias enfermedades víricas de la planta. Los insectos chupadores de savia de las plantas tienen típicamente un ciclo corto de vida, y son capaces de construir muy rápidamente inmensas poblaciones en una planta hospedante. Antecedentes de la invención E04818796 27-12-2011 La Solicitud PCT publicada WO 00/01846 se refiere generalmente a un método para aliviar la infestación de plagas de plantas, método el cual comprende a) identificar una secuencia de ADN de dicha plaga que es crítica para su supervivencia, crecimiento, proliferación o reproducción, b) clonar dicha secuencia o un fragmento de la misma en un vector adecuado con relación a uno o más promotores capaces de transcribir dicha secuencia en ARN o dsRNA al unir un factor de transcripción apropiado a dichos promotores, y c) introducir dicho vector en la planta. Las plagas de las plantas citadas en esta solicitud PCT publicada son nematodos. La patente US 6.326.193 se refiere al uso de virus recombinantes de insectos, tales como baculovirus que expresan dsRNA, para silenciar genes seleccionados de insectos. La Solicitud PCT publicada WO 99/32619 describe generalmente que se puede usar dsRNA para reducir la destrucción de cosechas por otros patógenos de plantas tales como arácnidos, insectos, nematodos, protozoos, bacterias, u hongos. Esta solicitud muestra que la bacteria de E. coli que expresa dsRNAs puede conferir efectos inhibidores específicos en larvas de nematodo C. elegans que se alimentan en estas bacterias. Timmons et al. (2001) describe que la ingestión de bacterias que expresan dsRNAs pueden producir interferencia genética en el nematodo Caenorhabditis elegans. Estos autores describen que, desde una perspectiva de la bioingeniería, puede ser posible usar dsRNA comestible manipulado mediante bioingeniería para modificar la expresión génica en cualquier organismo que tenga una respuesta a dsRNA específica de genes similar a la de C. elegans. Para responder a tal intervención, el organismo diana necesitaría tener tanto un mecanismo de respuesta a dsRNA (RNAi) como un mecanismo de captación/diseminación de dsRNA que produjese respuestas tales como las observadas en C. elegans. De forma similar, también se dio a conocer la inhibición de la expresión génica tras la ingestión de bacterias que expresan ARN bicatenario para platelmintos planarios de agua fresca (Newmark et al., 2003). La Solicitud de Patente PCT publicada WO 2004/005485 describe el uso de vectores que comprenden secuencias diseñadas para controlar nematodos parásitos de plantas mediante interferencia de ARN, y plantas transgénicas transformadas con tales vectores. La Solicitud de Patente US publicada 20030180945 describe generalmente genes quiméricos capaces de producir ARN antisentido o sentido equipado con un promotor procariota adecuado para la expresión del ARN antisentido o sentido en un hospedante procariota particular. El hospedante procariota se puede usar como una fuente de ARN antisentido y/o sentido, por ejemplo alimentándolo a un animal, tal como un nematodo o un insecto, en el que se prevé el silenciamiento de un gen diana y se monitoriza mediante reducción de la expresión del gen informador. El gen diana y los genes informadores deberían ser genes presentes en las células del organismo eucariota diana, y no en el organismo hospedante procariota. La Solicitud de Patente US publicada 20030154508 describe un método para el control de plagas que comprende exponer dicha plaga a un compuesto que destruye, en dicha plaga, un transportador de aminoácido 2   catiónico/proteína de canal. Generalmente se describen células vegetales modificadas genéticamente para producir al menos un RNAi bicatenario que se diseña para ser ingerido por las plagas durante la alimentación para bloquear la expresión (o la función) de un gen diana. Se describe que se puede usar RNAi para reducir o prevenir la traducción de mensajes en cualquier tejido de la plaga debido a su capacidad para cruzar fronteras celulares y tisulares. Se describe además que RNAi, que se pone en contacto con una plaga mediante empapamiento, inyección o consumo de una fuente alimentaria, cruzará las fronteras tisulares y celulares, y que RNAi también se puede usar como un factor epigenético para prevenir la proliferación de generaciones subsiguientes de plagas. La Solicitud de Patente PCT publicada WO 01/37654 describe generalmente dsRNA dirigido contra insectos perforadores/chupadores e insectos masticadores, y que los RNAs bicatenarios destinados a conferir resistencia a insectos chupadores de savia se expresarían preferentemente en tejidos vegetales en los que se alimentan tales insectos, por ejemplo elementos del floema primario y secundario, y serían ingeridos por el insecto vía su mecanismo chupador, por ejemplo su estilete. El único insecto para el que se ejemplifica la aplicación de dsRNA es Manduca sexta, un insecto lepidóptero. La susceptibilidad de este insecto a RNAi se determinó tratando larvas con dsRNA mediante alimentación o mediante inyección directa. Los resultados de estos experimentos muestran que, con secuencias de dsRNA derivadas de tres genes separados, la inyección en M. sexta conduce a una disminución sustancial de la expresión del gen endógeno. No se dan resultados del experimento de alimentación. La Solicitud de Patente PCT publicada WO 02/14472 describe métodos para inhibir la expresión de un gen diana, expresando en una célula un constructo de ácido nucleico que comprende una repetición invertida y una región sentido o antisentido que tiene identidad de secuencia sustancial con un gen diana, en los que la repetición invertida no está relacionada con el gen diana. Como una de las posibles dianas, se enumeran insectos tales como insectos chupadores. La Solicitud de Patente publicada US 20030150017 describe el uso de moléculas de ARN homólogas o complementarias a una secuencia nucleotídica de una plaga de plantas tal como nematodos e insectos. En los Ejemplos se sugiere la aplicación de RNAi a una especie de insecto modelo, el insecto lepidóptero Helicoverpa armigera, en el modelo de planta de lechuga, pero no se realiza ningún experimento de alimentación ni se dan los resultados. La Solicitud de Patente PCT publicada WO 03/004644 A1 describe que la distancia evolutiva entre nematodos e insectos es considerable, y que no hay ninguna razón para suponer que mientras que la alimentación de dsRNA a C. elegans fue exitosa, sería una técnica fácilmente transferible a insectos. Describe además el uso de tecnología de dsRNA para artrópodos, y muestra que la alimentación directa de dsRNA desnudo, sin empaquetar, fracasó a la hora de producir un fenotipo de RNAi en Drosophila melanogaster y Helicoverpa armigera, indicando que fueron necesarios agentes que promueven la transfección, tales como liposomas, indicando que fueron necesarios agentes promotores de la transfección, tales como liposomas, para la transfección efectiva en estas especies. Esta solicitud prevé generalmente que, en artrópodos con un sistema digestivo simple, dsRNA desnudo puede ser efectivo obteniendo el silenciamiento génico. En esta solicitud no se incluyen resultados del suministro de dsRNA desnudo a ningún artrópodo. Gura (2003) describe que mientras que en la alimentación de C. elegans de cepas de E. coli manipuladas mediante ingeniería para producir el ARN bicatenario puede activar RNAi, la alimentación en el insecto Drosophila de células de levadura manipuladas para obtener ARN... 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1. Un método para silenciar un gen de un insecto chupador de savia de las plantas, que comprende aplicar a la dieta o al alimento de dicho insecto chupador de savia de las plantas dsRNA o siRNA sin agentes promotores de la transfección, dsRNA o siRNA el cual se dirige a un gen esencial de un insecto chupador de savia de las plantas. 2. Un método para identificar la función génica en un insecto chupador de savia de las plantas, que comprende la etapa de aplicar dsRNA o siRNA, que selecciona como diana un gen de insecto chupador de savia de las plantas, a la dieta de dicho insecto, y evaluar cambios fenotípicos o bioquímicos en dicho insecto, en el que dicho dsRNA o siRNA se aplica sin agentes promotores de la transfección. 3. Un método para identificar nuevas dianas para compuestos insecticidas, que comprende las etapas de: a) aplicar dsRNA o siRNA sin agentes promotores de la transfección al alimento o dieta de un insecto chupador de savia de las plantas; b) analizar qué genes, cuando se silencian, confieren letalidad a dicho insecto, c) clonar y caracterizar dichos genes así analizados; d) identificar compuestos que destruyen o inactivan dicho gen o el ARN o proteína codificado de ese modo; y e) poner en contacto dichos compuestos con dicho insecto o alimento o dieta de dicho insecto para confirmar la naturaleza plaguicida de dicho compuesto. 4. Un método para obtener mortalidad significativa de insectos o control significativo de insectos silenciando un gen esencial de un insecto chupador de savia de las plantas mediante aplicación de dsRNA o siRNA al alimento de dicho insecto, en comparación con insectos de control alimentados en dsRNA o siRNA que selecciona como diana un gen no esencial o un gen no expresado en el insecto chupador de savia de las plantas. 5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4, en el que dicho gen del insecto chupador de savia es homólogo a un gen que, cuando se silencia parcial o completamente en un insecto tal como Drosophila, da como resultado un mutante con un fenotipo letal, y en el que 2 genes son homólogos cuando son similares en secuencia en un grado tal que, cuando las dos secuencias se alinean, el número de posiciones con nucleótidos idénticos dividido entre el número de nucleótidos en la más corta de las secuencias es mayor que 70%. 6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4, en el que dicho gen del insecto chupador de savia es un gen cuyo silenciamiento provoca una disminución del crecimiento, del desarrollo, de la reproducción o de la supervivencia de un insecto chupador de savia de las plantas, en comparación con insectos de control alimentados en dsRNA o siRNA que selecciona como diana un gen no expresado en el insecto chupador de savia de las plantas. 7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 a 6, en el que dicho dsRNA o siRNA no silencia genes de una planta, o de animales no dianas, tales como depredadores del insecto chupador de savia de las plantas, o animales tales como reptiles, anfibios, pájaros, o mamíferos. 8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 a 7, en el que se selecciona una porción de una secuencia diana que está presente en varios insectos chupadores de savia de las plantas de un hospedante vegetal en secuencia idéntica o con elevada identidad de secuencia, en el que una secuencia con elevada identidad de secuencia se refiere al número de posiciones con nucleótidos idénticos dividido entre el número de nucleótidos en la más corta de las secuencias, siendo mayor que 95%. 9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 a 8, en el que dicho gen del insecto chupador de savia se selecciona del grupo que consiste en: el gen del factor 1A de iniciación de la traducción eucariota (eIF1A), un gen de (alfa) tubulina, un gen de alfa-actinina, y un gen del receptor de ecdisona. 10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 a 9, en el que dicho gen del insecto chupador de savia de las plantas son aquellos genes de insectos chupadores de savia de las plantas identificados usando los cebadores de una cualquiera de SEC ID NO: 1-4 y SEC ID NO: 9 y 10, o genes de insectos chupadores de savia de las plantas que corresponden a o que comprenden una cualquiera de las secuencias de SEC ID NO: 5 a 8, SEC ID NO: 11 o SEC ID NO: 12, así como genes de áfidos homólogos a las secuencias de SEC ID NO: 5 a 8, SEC ID NO: 11 o SEC ID NO: 12, en el que 2 genes son homólogos cuando son similares en secuencia en un grado tal que, cuando se alinean las dos secuencias, el número de posiciones con nucleótidos idénticos dividido entre el número de nucleótidos en la más corta de las secuencias es mayor que 70%. 11. El método de la reivindicación 10, en el que el dsRNA o siRNA selecciona como diana a la secuencia de eIF1A de A. gossypii SEC ID NO: 5 solamente en la porción de la posición nucleotídica 72 hasta el extremo de SEC ID NO: 5. 12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 a 9, en el que dicho gen del insecto chupador de savia de las plantas comprende la secuencia de una cualquiera de SEC ID NO: 5 a 8, o SEC ID NO: 12. 28 E04818796 27-12-2011