REDUCCIÓN DE ENDOTOXINA EN ÁCIDOS POLISIÁLICOS.

[0001] La presente invención se refiere a la reducción de endotoxina en el ácido polisiálico (PSA) y sus conjugados mediante la incubación con una base fuerte, seguido por la recuperación del PSA, habitualmente por la adsorción y elución de una columna de intercambio. El ácido PSA con contenido de endotoxina reducido puede ser usado para sistemas de administración de medicamentos de derivatización, incluyendo proteínas y fármacos péptidos, lo que mejora las farmacocinéticas y las farmacodinamias de los fármacos. [0002] Los ácidos polisiálicos son polímeros no ramificados de origen natural del ácido siálico producidos por ciertas cepas bacterianas y en los mamíferos en ciertas células [Roth y otros, 1993]. Se pueden producir en varios grados de polimerización desde n=alrededor de 80 o más residuos de ácido siálico hasta n=2 por hidrólisis ácida limitada o por digestión con neuraminidasas, o por el fraccionamiento de las formas naturales bacterialmente derivadas del polímero. La composición de diferentes ácidos polisiálicos también varia de tal forma que hay formas homopoliméricas, es decir, el ácido polisiálico alfa-2, 8-enlazado que comprende el polisacárido capsular de la cepa E. coli K1 y el grupo B meningococci, que también se encuentra en la forma embrionaria de la molécula de adhesión celular neuronal (N-CAM). Las formas heteropoliméricas también existen tales como el ácido polisiálico alternando alfa-2,8 alfa-2,9 de la cepa de E. coli K92 y polisacáridos de grupo C de N. meningitidis. El ácido siálico puede también ser encontrado en la alternancia de copolímeros con monómeros que no sean ácido siálico como el grupo W135 o el grupo Y de N. meningitidis. Los ácidos polisiálicos tienen importantes funciones biológicas incluyendo la evasión de los sistemas inmunológico y complementario por bacterias patogénicas y la regulación de la adhesividad de gliales de las neuronas inmaduras durante el desarrollo fetal (en donde el polímero tiene una función antiadhesiva) [Muhlenhoff y otros, 1998], a pesar de que no hay receptores conocidos para los ácidos polisiálicos en mamíferos. El ácido polisiálico alfa-2,8-enlazado de la cepa de E. coli K1 también es conocido como ácido colomínico (CA) y es usado (en varias longitudes) para ejemplificar la presente invención. [0003] La forma alfa-2,8 enlazada del ácido polisiálico, entre los polisacáridos bacterianos, es no-inmunogénica (no provocando respuestas ni de células T ni de anticuerpos en sujetos mamíferos, incluso cuando se conjuga con proteínas portadoras inmunogénicas) que puedan reflejar su status como un polímero mamífero (así como bacteriano). Las formas más cortas del polímero (hasta n=4) se encuentran en gangliósidos de la superficie celular, que están ampliamente distribuidos en el cuerpo, y se cree que imponen y mantienen efectivamente la tolerancia inmunológica al ácido polisiálico. En años recientes, las propiedades biológicas de los ácidos polisiálicos, particularmente las del ácido polisiálico homopolimérico alfa-2,8 enlazado han sido aprovechadas para modificar las propiedades farmacocinéticas de la proteína y las moléculas de fármacos de bajo peso molecular [Greoriadis, 2006; Jain y otros, 2003; US-A-5846.951; WO-A-0187922]. La derivatización del ácido polisiálico da lugar a mejoras impresionantes en la vida media de circulación para un número de proteínas terapéuticas incluyendo la catalasa y la asparaginasa, y también permite que tales proteínas sean usadas en presencia de anticuerpos preexistentes surgidos como una consecuencia no deseada (y algunas veces inevitable) de una exposición anterior a la proteína terapéutica. En muchos aspectos, las propiedades modificadas por las proteínas polisialiladas son comparables a las proteínas derivatizadas con polietilenglicol (PEG). Por ejemplo, en cada caso, las vidas medias se aumentan, y las proteínas y los péptidos son más estables a la digestión proteolítica, pero la retención de la actividad biológica parece ser mayor con el PSA que con el PEG [Hreczuk-Hirst y otros, 2002]. También hay preguntas sobre el uso del PEG con agentes terapéuticos que han de ser administrados crónicamente, ya que el PEG es sólo muy lentamente biodegradable [Beranova y otros, 2000] y las formas con alto peso molecular tienden a acumularse en los tejidos [Bendele y otros, 1998; Convers y otros 1997]. Se ha descubierto que las proteínas PEGladas generan anticuerpos PEG que pueden también influenciar el tiempo de residencia del conjugado en la circulación sanguínea [Cheng y otros, 1999]. A pesar de la historia establecida del PEG como un polímero administrado parenteralmente conjugado a las terapéuticas, se requerirá una mejor comprensión de su inmunotoxicología, farmacología y metabolismo [Hunter y Moghimi, 2002]. De igual modo hay preocupación sobre la utilidad del PG en agentes terapéuticos que pueden requerir altas dosificaciones, ya que la acumulación de PEG puede llevar a la toxicidad. El ácido polisiálico alfa-2,8 enlazado por lo tanto ofrece una alternativa atractiva al PEG, siendo un polímero biodegradable inmunológicamente invisible que es parte natural del cuerpo humano, y que se degrada, por las neuraminidasas del tejido, a ácido siálico, un sacárido ni tóxico. Sin embargo, el PSA bruto se contamina con altos niveles de endotoxina lo que limita su utilidad terapéutica. [0004] Nuestro grupo ha descrito, en ensayos anteriores y en patentes concedidas, la purificación y el fraccionamiento del PSA y su utilidad para mejorar las propiedades farmacocinéticas de proteínas terapéuticas [Gregoriadis, 2006, Jain y otros, 2004; US-A-05846.951; WO-A-0187922]. Ahora describimos la preparación de PSAs purificados con contenido reducido de endotoxina que pueden ser usados para producir proteínas derivatizadas del PSA, y otros agentes terapéuticos. Estos nuevos materiales y métodos son particularmente adecuados para la producción de agentes terapéuticos derivatizados del PSA destinados para su uso en humanos y animales, en los que la definición química y molecular de las entidades del fármaco es de la mayor importancia debido a las éticas médicas y los requisitos de seguridad de las autoridades reguladoras como la FDA y la EMEA. 2   [0005] La endotoxina (que es un lipopolisacárido) fue primero definida por Richard Pfeiffer en 1892 como una sustancia tóxica estable al calor liberada por la ruptura de cubiertas microbianas. La respuesta inflamatoria en el huésped infectado resulta en la producción de toxicidad lo que parece estar adaptado óptimamente para la limpieza de la mayoría de las infecciones locales. Sin embargo, también puede tener lugar una respuesta inflamatoria que lleva a un shock séptico y la muerte cuando hay una distribución sistémica de las infecciones severas. [0006] Este lipopolisacárido (LPS) se utiliza en la mayoría de los pasos que tienen lugar durante la presentación de la endotoxina a las células mieloides del sistema inmune y la producción de las citocinas inflamatorias. El componente más potente del LPS es el lípido A y se ha convertido en sinónimo de la endotoxina. También se hace referencia como endotoxina a los mediadores inflamatorios de las bacterias como el peptidoglicano, la fracción diacilglicerilcisteina de las lipoproteínas bacterianas, y las firmas de ácidos nucleicos bacterianos. Recientemente, se ha descubierto que el receptor tipo Toll (TLR4) es el transductor de señal inflamatorio del lípido A. Además, se han identificado los transductores de señales para diferentes mediadores inflamatorios. La estructura de la endotoxina es importante ya que su elucidación facilita un entendimiento de cómo puede ser retirada. [0007] El LPS está formado de tres partes: la región del lípido hidrofóbico, proximal, que ancla el LPS a las valvas exteriores del OM, la distal, repeticiones del O-antigeno hidrofílico, que se extiende en el medio acuoso, y el núcleo oligosacárido interconectando. El O-antígeno y los azúcares fundamentales aunque no son esenciales para la supervivencia, proporcionan resistencia bacteriana contra varios agentes antimicrobianos incluyendo detergentes y el complejo de ataque de la membrana del complemento sérico. [0008] Las células del tipo salvaje que producen el O-antígeno debido a su colonia brillante son conocidas como suaves y las que no tienen el O-antígeno son conocidas como rugosas. A las moléculas que contienen el polisacárido O-antígeno se hace referencia habitualmente como LPS y las moléculas que carecen del O-antígeno, como en la Neisseria, son denominadas lipooligosacáridos o LOS. Como el Lípido A es esencial para la supervivencia y también es un potente mediador inflamatorio, es conocido un objetivo para el desarrollo de antibióticos y agentes antiinflamatorios. [0009] Muchos mediadores... [Seguir leyendo]

1. El proceso para reducir el contenido de endotoxina de una muestra que contiene ácido polisiálico y endotoxina que comprende los pasos secuenciales de: (i) Añadir a la muestra una base que tiene un pKa de al menos 12 para formar una solución básica que tiene un pH de al menos 12, incubar la solución durante un tiempo a una temperatura; y (ii) recuperar el ácido polisiálico que tiene un contenido de endotoxina reducido. 2. El proceso de acuerdo a la reivindicación 1 en donde la base tiene un PkA de al menos 13. 3. El proceso de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2 en donde el pH de la mencionada solución básica es de al menos 13. 4. El proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde la base es NaOH, KOH, Ca(OH)2 o LiOH. 5. El proceso de acuerdo a la reivindicación 4 en donde la base es 2N NaOH. 6. El proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el tiempo mencionada varía de 5 20 minutos a 24 horas y donde la mencionada temperatura está en el intervalo de 0º a 60º C.   7. El proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el paso (ii) incluye los siguientes subpasos secuenciales: (iii) pasar la muestra a través de una columna de intercambio de aniones por lo que el ácido polisiálico es adsorbido en la resina de intercambio de iones. (iv) lavar la columna con un regulador de lavado, por lo que el ácido polisiálico permanece adsorbido en la resina de intercambio de iones; y (v) eluir el ácido polisiálico de la columna usando un regulador de elución para proporcionar una solución de producto de ácido polisiálico que tiene un contenido de endotoxina reducido. 8. Un proceso de acuerdo a la reivindicación 7, en donde la muestra, tras el paso (i), es neutralizada antes del paso (ii). 9. El proceso de acuerdo a la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en donde en el paso (iv), la columna se lava en un primer paso con un primer regulador de lavado de baja fuerza iónica para eluir la endotoxina de la columna y en donde el regulador de elución usado en el paso (v) tiene una fuerza iónica más alta. 10. el proceso de acuerdo a la reivindicación 9, en donde el mencionado regulador de lavado y/o el mencionado regulador de elución contiene una base volátil. 11. El proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde en el paso (iv) la columna se lava más de una vez. 12. El proceso de acuerdo a la reivindicación 11, que comprende lavar la columna con un segundo regulador de lavado, que comprende NaCl a una concentración de al menos 0,2 M. 13. El proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 en donde los pasos (i) y (iii) a (v) son repetidos en la solución del producto. 14. El proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende al menos un paso adicional en el que el nivel de endotoxina del ácido polisiálico se reduce por la purificación llevada a cabo ya sea antes del paso (i), entre los pasos (i) y (ii) o tras el paso (ii) seleccionada de cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía por afinidad, cromatografía por exclusión de tamaño o combinaciones de las mismas. 15. El proceso de acuerdo a la reivindicación 14, en donde la cromatografía de interacción hidrofóbica se lleva a cabo antes del paso (i) 16. El proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde la muestra de ácido polisiálico ya sea antes del paso (i), entre los pasos (i) y (ii) o tras el paso (ii), se incuba con un surfactante, un gente quelante, un solvente orgánico, un oxidante o una peroxidasa. 17. El proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un paso preliminar en el que el E. coli se fermenta para producir un caldo de fermentación que contiene el ácido polisiálico y la endotoxina, 12   opcionalmente comprendiendo los pasos intermedios de retirar la proteína, el lípido, el ácido nucleico y/o los nutrientes, para formar la mencionada muestra. 18. El proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el contenido de endotoxina del ácido polisiálico en la solución del producto no es más de 25 EU/mg de ácido polisiálico, medido por la prueba LAL. 19. El proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde la muestra contiene conjugado de ácido polisiálico-proteína y endotoxina. 20. El proceso de acuerdo a la reivindicación 19 en donde el contenido reducido de endotoxina no es más de 5 EU/mg. 21. El proceso de acuerdo a la reivindicación 20 en donde el contenido reducido de endotoxina no es más de 0,5 EU/mg. 22. El proceso para preparar un conjugado de molécula ácido polisiálico-biológica, que comprende reducir el contenido de endotoxina de una muestra que contiene ácido polisiálico de acuerdo al proceso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores y conjugar el ácido polisiálico obtenido con la molécula biológica. 23. El proceso de acuerdo a la reivindicación 22, en donde la molécula biológica es una proteína. 13