Suministro de ARN interferente pequeño.

Un método para preparar una composición de ARNip liposomal que comprende las etapas de:

i) proporcionar una suspensión acuosa de liposomas vacíos que tienen un diámetro promedio en el intervalo de 20 a 200 nm y están formados de componentes neutros formadores de liposomas;

ii) mezclar en la suspensión ARNip bicatenario y azúcar en una cantidad en el intervalo de 0.1 a 10.0% en peso basado en el peso de los componentes formadores de liposomas para formar una suspensión mixta, y en que la relación en peso de azúcar con respecto a los componentes formadores de liposomas está en el intervalo de 0.75:1 a 7:1; y

iii) deshidratar la mezcla formada en la etapa ii) para formar una composición deshidratada,

en donde los liposomas formados por rehidratación de la composición deshidratada tienen un diámetro promedio en el intervalo de 100 a 500 nm y en donde el ARNip y el azúcar están cada uno atrapados en el espacio intravesicular de los liposomas.

Suministro de ARN interferente pequeïo La presente invenciïn se refiere a un nuevo vehïculo de suministro para ARN interferentes pequeïos (ARNip) , especïficamente un sistema de suministro liposomal.

Un ARN interferente pequeïo (o ARN interferente corto) es un hïbrido bicatenario que silencia la expresiïn de un gen diana a travïs del proceso de interferencia de ARN. El hïbrido es un sustituto en el proceso natural de silenciamiento de genes en un proceso en que el hïbrido se desenrolla, una de las cadenas se asocia con una molïcula diana de ARNm en un complejo denominado el complejo silenciador inducido por ARN (RISC) que conduce a la destrucciïn del ARNm. El ARNip tiene el potencial de regular negativamente la expresiïn de genes in vivo.

Un sistema modelo de ensayo de la reducciïn de genes implica la introducciïn de un gen reportero exïgeno de ºgalactosidasa introducido endïgenamente en cultivos celulares. Spagnou y otros, (2004) Biochemistr y , 43, 13348-13356 describen una transfecciïn in vitro de un ARNip dirigido a la º-galactosidasa, mediante la formaciïn de complejos liposomales catiïnicos. Los autores describen los complejos en tïrminos comparables a los bien conocidos complejos ADN/lïpido, como partïculas Lipoplex. Sin embargo Spagnou y otros, explican que los ARNip, al ser pequeïas partïculas subnanomïtricas, pueden no estar protegidos adecuadamente por tales complejos de una degradaciïn enzimïtica o fïsica. Sin embargo ellos usan tïcnicas de formulaciïn mediante el uso de una mezcla fïsica de SUV vacïos formados de mezclas de lïpidos catiïnicos/neutros con ARNip.

Judge, y otros, en Molecular Therapy 2006, 13 (3) 494-505, investigan mïtodos de atrapamiento de ARNip para proteger al sujeto que recibe una terapia con ARNip de los efectos secundarios a partir de respuestas inmunes innatas no deseadas al material de ARNip que tiene tendencia a activar los receptores tipo toll y estimular la producciïn de interferïn tipo I, asï como incrementar la captaciïn celular del ARNip. Judge, y otros, muestran que la actividad inmunoestimulante de los ARNip puede reducirse mediante modificaciones a una cadena del hïbrido, por ejemplo la modificaciïn quïmica del grupo ribosil 2'-OH mediante metilaciïn o fluoraciïn. Judge, y otros, usan el atrapamiento en liposomas con el objetivo de proteger los ARNip contra una digestiïn por nucleasas in vivo. Ellos usan ARNip especïficos para la apolipoproteina B (apoB) , la que reduce selectivamente la expresiïn de apoB en el hïgado como se ha demostrado previamente. El ARNip encapsulado se suministrï por vïa intravenosa a ratones y se demostrï que los niveles de apoB en suero, y de esta manera la apoB unida a colesterol, se redujeron, a pesar de los sïntomas de toxicidad con los hïbridos de ARNip sin modificar ilustrados por pïrdida de peso de 1-3 dïas despuïs de la administraciïn. Los liposomas encapsulantes se formaron de una mezcla de lïpidos catiïnicos y neutros y pegilados. Judge, y otros, lograron una reducciïn de la toxicidad mediante la metilaciïn de grupos ribosilo en algunos de los residuos de ribosa de una cadena del hïbrido de ARNip.

Hemos descrito previamente el atrapamiento de vacunas gïnicas en el espacio intravesicular de liposomas, y hemos mostrado que esto logra resultados de protecciïn ïtiles. Hemos usado liposomas formados de lïpidos catiïnicos y neutros en combinaciïn, asï como liposomas neutros. En el documento WO9810748 mostramos que se logra una mejor respuesta inmune mediante el uso de liposomas catiïnicos que de liposomas neutros. Usamos la tïcnica de atrapamiento liposomal de vesïculas por deshidrataciïn/rehidrataciïn (DRV) , descrita originalmente por Kirby y Gregoriadis, y otros, en Bio/technology 1984, 979-984.

Ademïs hemos descrito el co-atrapamiento liposomal de antïgeno peptïdico y vacuna gïnica, que codifica un antïgeno peptïdico que comparte al menos uno y preferentemente varios epïtopos con el antïgeno peptïdico en W02004004758. Se usï el mïtodo de DRV, mediante el uso de liposomas catiïnicos.

El mïtodo DRV implica un proceso en que pequeïos liposomas unilamelares (SUV) vacïos que tienen un diïmetro promedio de hasta alrededor de 100 nm, se mezclan con una soluciïn acuosa del activo a atrapar, la mezcla se deshidrata, y se rehidrata subsecuentemente. Los liposomas formados subsecuentemente tienen el activo atrapado en el espacio intravesicular de los liposomas que tienen un diïmetro promedio mayor que los SUV iniciales. Hemos demostrado que los tamaïos de los liposomas pueden controlarse mediante inclusiïn de azïcar en la mezcla SUV/activo, en el documento WO9965465. Hemos demostrado que esta tïcnica es de utilidad para el co-atrapamiento de vacuna gïnica y antïgeno peptïdico para el antïgeno de superficie de la hepatitis B y la HA de la gripe.

A diferencia de la vacunaciïn, donde la exposiciïn a vehïculos lipïdicos es una experiencia transitoria, tal vez de una vez en la vida, las indicaciones de enfermedades para ARNip incluyen enfermedades crïnicas, en donde se esperarïa que la dosificaciïn fuera de manera crïnica. Se ha demostrado que la administraciïn repetida de lïpidos catiïnicos podrïa tener efectos adversos ver mïs abajo.

Landen, y otros, en Cancer Research 2005, 65 (15) 6910-6918, describen la incorporaciïn de ARNip dirigidos a la oncoproteïna EphA2 en el interior de vehïculos liposomales y mostraron que el producto es altamente eficaz en la reducciïn in vivo de la expresiïn de EphA2 en un modelo murino de cïncer de ovario. Los liposomas se formaron de dioleoil fosfatidilcolina, que mostrï mejora del suministro en 10 veces sobre liposomas formados de un lïpido catiïnico.

Landen, y otros, seïalan que un lïpido catiïnico se capta preferentemente por el hïgado y el bazo, lo que puede limitar su eficacia en una terapia sistïmica. Ellos concluyen que DOPC equilibra la captaciïn eficiente de ARNip en el interior de un liposoma en preparaciïn, la captaciïn del liposoma en el interior de una cïlula y la ruptura del liposoma intracelular con liberaciïn del ARNip en el citoplasma. Un trabajo posterior publicado en Halder, y otros, Clin. Cancer Res. 2006, 12 (16) 4916-4924 describe un atrapamiento liposomal en liposomas similares de ARNip dirigidos a la quinasa de adhesiïn focal, de nuevo para tratamiento del cïncer de ovario. De nuevo se seïala que los liposomas catiïnicos tienen problemas de toxicidad al promover inflamaciïn pulmonar, asï como que tienen un ïxito limitado en el suministro de ARNip, lo cual se cree que es debido a la formaciïn de liposomas excesivamente estables que no se desintegran intracelularmente para liberar el ARNip.

Landen, y otros, y Halder, y otros, usan una tïcnica de atrapamiento liposomal que implica la mezcla de lïpidos y el activo en presencia de butanol terciario y tween, seguido por liofilizaciïn y despuïs rehidrataciïn. No revelan el tamaïo de los liposomas. Es importante que se elimine el alcohol pero esto puede ser difïcil y es inconveniente. Ademïs la eliminaciïn del tween es deseable pero tïcnicamente difïcil.

El documento Estados Unidos 2007/0172430 (Brito y otros) describe preparaciones de liposomas formuladas como polvos secos para suministro mucosal, intranasal, por inhalaciïn o pulmonar que puede incluir uno o mïs ARNip o precursores dicer-activo de estos, dirigidos a un transcripto implicado en la infecciïn, o la replicaciïn o la producciïn de un virus de la gripe.

Pons y otros (International Journal of Pharmaceutics, 95 (1993) 51-56) describen liposomas obtenidos mediante el uso de variantes del mïtodo de inyecciïn de etanol y encapsulaciïn de los fïrmacos ciprofloxacina y enrofloxacina en ellos.

Batzri y Korn (Biochimica et Biophysica Acta, 298 (1973) 1015-1019) describen la producciïn de liposomas mediante la inyecciïn de una soluciïn etanïlica de fosfolïpido en agua. Los liposomas resultantes son indistinguibles de los liposomas obtenidos por sonicaciïn.

El documento WO 2006/113679 (Junta de Regentes del Sistema de la Universidad de Texas) describe la encapsulaciïn de molïculas de ARNip en liposomas para su suministro a una cïlula. Los liposomas se produjeron al mezclar el fosfolïpido con ARNip, butanol y tween-20 mediante un mïtodo descrito por Landen y otros, anteriormente.

Maitani y otros (International Journal of Pharmaceutics 356 (2008) 69-75) describen la producciïn de liposomas liofilizados que contienen ADN mediante un mïtodo que usa una mezcla de lïpidos/azïcar. Maitani y otros describen el efecto de variar la relaciïn azïcar: lïpido y el tipo de azïcar usada, sobre la estabilidad durante el almacenamiento de los liposomas liofilizados que contienen ADN.

El documento Estados Unidos... [Seguir leyendo]

1. Un mïtodo para preparar una composiciïn de ARNip liposomal que comprende las etapas de:

i) proporcionar una suspensiïn acuosa de liposomas vacïos que tienen un diïmetro promedio en el intervalo de 20 a 200 nm y estïn formados de componentes neutros formadores de liposomas; ii) mezclar en la suspensiïn ARNip bicatenario y azïcar en una cantidad en el intervalo de 0.1 a 10.0% en peso basado en el peso de los componentes formadores de liposomas para formar una suspensiïn mixta, y en que la relaciïn en peso de azïcar con respecto a los componentes formadores de liposomas estï en el intervalo de 0.75:1 a 7:1; y iii) deshidratar la mezcla formada en la etapa ii) para formar una composiciïn deshidratada,

en donde los liposomas formados por rehidrataciïn de la composiciïn deshidratada tienen un diïmetro promedio en el intervalo de 100 a 500 nm y en donde el ARNip y el azïcar estïn cada uno atrapados en el espacio intravesicular de los liposomas.

2. Un mïtodo de acuerdo a la reivindicaciïn 1, en que el azïcar es un monosacïrido o un disacïrido.

3. Un mïtodo de acuerdo a la reivindicaciïn 2, en que el azïcar es un disacïrido.

4. Un mïtodo de acuerdo a la reivindicaciïn 3, en que el azïcar es sacarosa.

5. Un mïtodo de acuerdo con cualquier reivindicaciïn precedente, en que los componentes formadores de liposomas comprenden una fosfatidilcolina y opcionalmente una fosfatidil etanolamina, y/u opcionalmente colesterol.

6. Un mïtodo de acuerdo con cualquier reivindicaciïn precedente, en que la relaciïn en peso del azïcar con respecto a los componentes formadores de liposomas estï en el intervalo de 0.9:1 a 5:1.

7. Un mïtodo de acuerdo con cualquier reivindicaciïn precedente, en que los liposomas vacïos de la etapa i) tienen un diïmetro promedio en el intervalo de 25 nm a 90 nm.

8. Un mïtodo de acuerdo con cualquier reivindicaciïn precedente, en que la etapa iii) es la liofilizaciïn.

9. Un mïtodo de acuerdo con cualquier reivindicaciïn precedente, en que la relaciïn en peso del azïcar con respecto a los componentes formadores de liposomas estï en el intervalo de 1:1 a 6:1.

10. Un mïtodo de acuerdo con la reivindicaciïn 9, en que la relaciïn en peso de azïcar con respecto a los componentes formadores de liposomas estï en el intervalo de 1:1 a 5:1.

11. Un mïtodo de acuerdo con cualquier reivindicaciïn precedente, en que los liposomas vacïos de la etapa i) tienen un diïmetro promedio en el intervalo de 50 a 90 nm.

12. Un mïtodo de acuerdo con cualquier reivindicaciïn precedente, que comprende la etapa adicional de:

iv) rehidratar la composiciïn deshidratada para formar una composiciïn liposomal rehidratada, en donde el ARNip y el azïcar estïn atrapados en el espacio intravesicular de los liposomas.

13. Un mïtodo de acuerdo con la reivindicaciïn 12, en que los liposomas de la composiciïn rehidratada tienen un diïmetro promedio en el intervalo de 100 a 200 nm.

14. Un mïtodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13, en que la composiciïn rehidratada se somete a microfluidizaciïn.

15. Un polvo que puede obtenerse mediante el mïtodo de las reivindicaciones 1-7, o las reivindicaciones 9-11, en donde la deshidrataciïn se lleva a cabo mediante secado por aspersiïn.

16. Una suspensiïn acuosa de liposomas que puede obtenerse mediante el mïtodo de las reivindicaciones 1-11, que comprende la etapa adicional de:

iv) rehidratar la composiciïn deshidratada para formar una composiciïn liposomal rehidratada, en donde el ARNip y el azïcar estïn cada uno atrapados en el espacio intravesicular de los liposomas.

17. Una suspensiïn acuosa de liposomas, en donde el ARNip y el azïcar estïn cada uno atrapados en el espacio intravesicular de los liposomas que puede obtenerse mediante el mïtodo de las reivindicaciones 12-14.