Un método para aumentar la inmunorreactividad de una muestra de tejido o células fijada en un medio de fijación que comprende:

- proporcionar un portador en una posición horizontal, y dicho portador tiene sobre él una muestra de tejido o células, y dicha muestra de tejido o células está sobre el portador,

- poner en contacto sustancialmente el lado de la muestra de tejido o células del portador con una disolución tamponada de recuperación de objetivos que comprende un disolvente con un punto de ebullición mayor que el punto de ebullición del agua, en el que la disolución de recuperación de objetivos permanece por lo demás expuesta al medio,

- calentar la muestra de tejido o células y la disolución de recuperación de objetivos a una temperatura superior a 100 °C.

Recuperación de antígeno horizontal

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para aumentar la inmunorreactividad de una muestra de tejido o células fijada en un medio de fijación, una composición de recuperación de objetivos y su uso. La invención se refiere además a la tinción inmunohistoquímica automatizada de dichas muestras, en particular a la reactivación de los antígenos enmascarados por la fijación.

Antecedentes Debido a la introducción de terapias especializadas para tipos específicos de cáncer, se está incrementando la importancia de la tinción inmunohistoquímica para el diagnóstico del cáncer. Además, la demanda creciente de un rendimiento elevado en los laboratorios de anatomía patológica, junto con la importancia de evitar cualquier error de procedimiento, ha acentuado la necesidad de automatizar los procedimientos inmunohistoquímicos.

La mayoría del tejido obtenido de muestras clínicas se fija en un fijador por entrecruzamiento tal como formaldehído. Este procedimiento detiene la degradación natural del tejido y así conserva intacta la morfología durante muchos años. La fijación forma entrecruzamientos entre los aminoácidos reactivos de las proteínas del tejido en forma de puentes de metileno y una red de poli-oxi-metileno, que impide la elución de las proteínas solubles y retiene las moléculas en una disposición espacial que se parece mucho al tejido vivo. Posteriormente, la muestra de tejido se deshidrata y se incrusta en un medio de incrustación, normalmente cera de parafina, lo que permite que el tejido se corte en secciones de hasta 2 I-lm.

La fijación, sin embargo, provoca cierta pérdida de antigenicidad. Las modificaciones introducidas en las proteínas cambian químicamente los epítopos reconocidos por los anticuerpos o impiden físicamente el acceso a los epítopos. Se han desarrollado muchos métodos de recuperación de antígenos o de recuperación de objetivos para restablecer la antigenicidad del tejido, y la mayoría pertenecen a uno de dos grupos.

Un método tradicional comprende tratar el tejido con una enzima proteolítica, que abre el tejido para permitir que los anticuerpos accedan a los antígenos. Para ciertos anticuerpos específicos, este método es el procedimiento de recuperación de antígenos preferido, pero posee ciertas limitaciones. Debido a que las enzimas proteo líticas degradan las proteínas tisulares, existe un riesgo significativo de destruir el epítopo específico de la proteína que es reconocido por el anticuerpo, y así la antigenicidad se puede perder, en vez de ser restablecida. Además, el tratamiento proteolítico prolongado puede provocar que las proteínas pierdan su estructura tridimensional, que también es importante para el reconocimiento anticuerpo-antígeno. Estos factores requieren obviamente un control estricto de los tiempos de incubación, no obstante el tiempo de incubación necesario depende en gran medida de la actividad de la enzima.

Durante el almacenamiento, las enzimas se degradarán lentamente, especialmente si la temperatura de almacenamiento es mayor que la recomendaba, y así la actividad de la disolución enzimática puede variar mucho con el tiempo. Esto significa que el tiempo óptimo de incubación cambia con la edad de la disolución enzimática, y de manera ideal se debería ajustar en consecuencia.

Otro factor que afecta a la eficacia de la recuperación proteo lítica de objetivos es la duración de la fijación del tejido. El grado de entrecruzamiento en el tejido se incrementa con el tiempo de fijación, y así el tejido que se ha fijado durante 72 horas necesitará un tratamiento proteolítico más largo que uno que se ha fijado durante 24 horas. Con frecuencia, sin embargo, la información concerniente al tiempo de fijación no está disponible, en cuyo caso no es posible hacer el ajuste correspondiente del tiempo de incubación enzimática.

Un método fundamentalmente diferente consiste en la ebullición del tejido en una disolución acuosa, también conocido como recuperación de antígenos inducida térmicamente (HIAR) . Este método de pretratamiento no depende tanto del tiempo de fijación como el pretratamiento enzimático, y se usa de manera más generalizada. La temperatura elevada acelera la hidrólisis de las modificaciones inducidas por el aldehído y el aldehído liberado se diluye en el agua, por lo que se impide que reaccione de nuevo con las proteínas.

En la HIAR convencional, los tiempos de ebullición típicos son de entre 20 y 40 minutos a 95-99 oC, dependiendo del antígeno, a los que se añade un tiempo de enfriamiento de aproximadamente 20 minutos antes de que los portaobjetos se puedan extraer con seguridad, sin riesgo de secar el tejido. Cuando la cubeta con la disolución fría de recuperación de objetivos se coloca en un baño de agua precalentado, requerirá de 20 a 30 minutos antes de que alcance 95-99 oC, lo cual se tiene que añadir al tiempo de procedimiento total. Mediante el uso de un horno de microondas se puede reducir esta etapa de calentamiento a 2-3 minutos tal como se describe en el documento USP 5.244.787, sin embargo los tiempos de ebullición y enfriamiento no cambian, y así el procedimiento total sigue durando de 45 a 60 minutos. El calentamiento de los portaobjetos y de la disolución de recuperación de objetivo en un autoclave o dispositivo presurizado similar puede reducir el tiempo de ebullición. Aquí, el tejido se puede hervir a temperaturas superiores a 100 oC. Esto tiene una importancia especial a altitudes elevadas, en las que el punto de

ebullición de las disoluciones acuosas disminuye en comparación con el nivel del mar. A pesar del tiempo de ebullición relativamente corto, el protocolo completo de HIAR tiene una duración similar a la del protocolo sin presurizar, debido a que el enfriamiento del líquido a una temperatura a la que el autoclave se puede abrir con seguridad consume mucho tiempo.

Además de agua destilada pura, se usan de manera rutinaria muchos reactivos para la recuperación de antígenos, que incluyen tampones Tris, Urea, EDTA, Citrato y solución salina. Además, muchas disoluciones contienen detergentes, y la selección comprende tanto tensioactivos jónicos como no jónicos. A pesar de la investigación exhaustiva en el área de la intensificación de tinciones, no se ha identificado ningún método o reactivo universal que funcione con todos los procedimientos inmunohistoquímicos o inmunocitoquímicos posteriores.

Los informes previos describen el uso de glicerol para la recuperación de antígenos. Beebe (Beebe, K., Microscopy Today, 1999, nO 9 (Noviembre) , 30-31) ha informado el uso de un 80% de glicerol en un método de recuperación de antígenos por inmersión convencional.

Aunque la recuperación de antígenos tradicional inducida térmicamente restablece la antigenicidad del tejido para una amplia diversidad de anticuerpos, el procedimiento tiene desventajas serias cuando se automatiza. El uso de tampones casi en ebullición en un tanque es difícil de incorporar a un instrumento de tinción inmunohistoquímica. El bombeo de tampón dentro y fuera del tanque y el calentamiento de la disolución de tampón consume tiempo, y el consumo de energía asociado a la ebullición del tejido es muy elevado. La evaporación de agua de la disolución tampón es elevada, y se debe añadir tampón adicional durante el tiempo de incubación. Además, el vapor puede provocar quemaduras a los operarios, y se condensará en otras partes del instrumento, donde puede poner en peligro los circuitos electrónicos del instrumento.

En conjunto, estos procesos añaden de manera significativa complejidad a un instrumento de tinción, y tales factores afectan obviamente al coste del instrumento.

Ventana Medical Systems tiene en su instrumento Benchmark® un procedimiento de recuperación horizontal de objetivos, en el que el tampón acuoso del portaobjetos de vidrio se cubre mediante un aceite, el denominado Liquid Coverslip TM, para reducir la evaporación durante el calentamiento. Además, la humedad dentro del instrumento se mantiene cerca del1 00%.

Otro ejemplo de un instrumento que realiza la recuperación de antígenos así como la tinción es el Bond-Max® de Vision Biosystems. Usa un cubreobjetos hueco que se coloca sobre el portaobjetos.

Los dos instrumentos mencionados anteriormente tienen el problema de que cualquier líquido se evaporará relativamente rápido a una temperatura cercana a su temperatura de ebullición, y ambos instrumentos... [Seguir leyendo]

1. Un método para aumentar la inmunorreactividad de una muestra de tejido o células fijada en un medio de fijación que comprende:

proporcionar un portador en una posición horizontal, y dicho portador tiene sobre él una muestra de tejido o células, y dicha muestra de tejido o células está sobre el portador, poner en contacto sustancialmente el lado de la muestra de tejido o células del portador con una disolución tamponada de recuperación de objetivos que comprende un disolvente con un punto de ebullición mayor que el punto de ebullición del agua, en el que la disolución de recuperación de objetivos permanece por lo demás expuesta al medio, calentar la muestra de tejido o células y la disolución de recuperación de objetivos a una temperatura superior a 100 oC.

2. El método según la reivindicación 1, en el que se coloca más de una muestra de tejido o células sobre el portador.

3. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la disolución tamponada de recuperación de objetivos tiene una evaporación mínima a una temperatura entre 100 oC y 150 oC.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la disolución de recuperación de objetivos se calienta a una temperatura entre 100 oC y 200 oC.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la disolución de recuperación de objetivos comprende un disolvente que tiene un punto de ebullición significativamente mayor que el punto de ebullición del agua.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el disolvente se selecciona del grupo que consiste en alcoholes, glicoles, cetonas, ésteres, amidas y nitrilos o una mezcla de los mismos.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el disolvente es glicerol.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el disolvente es propilen glicol o etilen glicol o una mezcla de los mismos.

9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la disolución de recuperación de objetivos comprende además uno o más reactivos capaces de romper los enlaces formados durante la fijación de la muestra biológica.

10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que la disolución de recuperación de objetivos comprende u.

4. 80% del disolvente.

11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que la disolución de recuperación de objetivos comprende alrededor de un 50% del disolvente.

12. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que comprende además la automatización de una o más de las etapas.

13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que comprende además la etapa de enfriar el portador y la disolución de recuperación de objetivos tras la etapa de calentamiento.

14. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, que comprende además la etapa de retirar la disolución de recuperación de objetivos de la superficie del portador tras la etapa de calentamiento y/o la (s) etapa (s) de enfriamiento.

15. El método según la reivindicación 14, en el que la disolución de recuperación de objetivos se retira de la superficie del portador con un disolvente adicional capaz de mezclarse con la disolución de recuperación de objetivos.

16. El método según la reivindicación 15, en el que el disolvente adicional es agua, un tampón de lavado acuoso o etanol.

17. El método según cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en el que la retirada de la recuperación de objetivos se lleva a cabo a temperatura ambiente o por encima de la temperatura ambiente.

18. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-17, que comprende además la etapa de teñir la muestra de tejido o células con una sonda.

19. El uso de una disolución de recuperación de objetivos que comprende glicerol, agua, y uno o más de los siguientes; un nucleófilo, un tampón, un agente quelante y un detergente para la recuperación de objetivos de una muestra de tejido o células, y dicha muestra de tejido o células está sobre un portador, en el que dicho portador está en una posición horizontal.