Construcciones de moléculas MHC y sus usos para el diagnóstico y terapia.

Una construcción de moléculas MHC en forma soluble en un medio de solubilización o inmovilizada en un soporte sólido o semi-sólido,

comprendiendo dicha construcción de moléculas MHC una molécula vehicular dextrano soluble unida al menos a 5 moléculas MHC, en el que dichas moléculas MHC están unidas a la molécula vehicular dextrano mediante más de una entidad de unión, en el que cada entidad de unión está unida a de 2 a 4 moléculas MHC.

Construcciones de moléculas MHC y sus usos para el diagnóstico y terapia La presente invención se refiere al campo de los compuestos poli-valentes que portan ligandos capaces de ligarse a contra receptores en células diana relevantes. Los compuestos poseen varias características ventajosas, que les hacen muy adecuados para un amplio rango de aplicaciones. En particular, la presente invención se refiere a nuevas construcciones de moléculas MHC que comprenden una o más moléculas MHC. La afinidad y avidez de las moléculas MHC de las construcciones son sorprendentemente altas. La posibilidad de presentar a células diana una pluralidad de moléculas MHC hace de las construcciones de moléculas MHC de la invención una herramienta extremadamente poderosa, por ejemplo, en el campo del diagnóstico. Está comprendido por la presente invención el uso de muestra montada de moléculas MHC, multímeros de moléculas MHC, y construcciones de moléculas MHC. La invención se refiere además en general al campo de la terapia, incluyendo métodos terapéuticos y composiciones terapéuticas. Las composiciones terapéuticas pueden aplicarse tanto in vivo como ex vivo.

Antecedentes de la invención La unión específica de ligandos a contra receptores en células diana controla muchas respuestas importantes en el organismo humano. Las implicaciones fisiológicas de la unión de ligandos a receptores para hormonas peptídicas, por ejemplo, receptores de insulina (IR) se ha conocido desde hace décadas. Las hormonas peptídicas pueden secretarse de un órgano y ejercer su efecto localmente o ser distribuidas por la sangre a tipos celulares o tejidos localizados a distancia. Nuestro conocimiento actual de las funciones biológicas relacionadas con una variedad de receptores ha surgido a partir de los estudios detallados de la unión de ligando, transducción de la señal y otras medidas de respuestas fisiológicas.

Recientemente, se han descrito interacciones ligando-receptor más complicadas que están relacionadas con la regulación de respuestas inmunes específicas. Por ejemplo, ahora es muy conocido que se requieren las interacciones bioquímicas entre moléculas de membrana específicas de epítopo peptídico codificadas por el Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC, en los seres humanos HLA) y receptores de células T (TCR) para incitar respuestas inmunes específicas. Este tipo de interacción ligando-receptor es de alguna manera más complicada, en comparación con los modelos más "convencionales" ligando-receptor como insulina e IR. La activación de las células T también requiere la señalización simultánea a través de otros receptores, y puede adquirir energía de unión adicional a partir de la unión entre otras moléculas de la membrana, por ejemplo, proteínas de adhesión, para asegurar un contacto físico cercano entre las células implicadas.

El sistema inmune específico (adaptativo) es una red compleja de células y órganos que trabajan conjuntamente para defender al cuerpo específicamente frente a ataques de invasores "extraños" o "no propios". Además, el sistema inmune también comprende una línea de defensa más inespecífica (denominada sistema inmune innato) que consiste en tipos celulares y tejidos, que por medios físicos y químicos proporcionan resistencia frente a invasores extraños.

La red celular del sistema inmune específico es una de las defensas principales del cuerpo frente a la enfermedad. Funciona frente a la enfermedad, incluyendo el cáncer, de varias maneras.

Así, un conocimiento detallado de los mecanismos moleculares que subyacen a la activación del sistema inmune humano puede tener no sólo un efecto profundo e importante para controlar las enfermedades en los seres humanos. Una comprensión detallada también proporcionará herramientas de diagnóstico para controlar infecciones y otras enfermedades en otras especies de vertebrados con importancia económica. Una comprensión detallada proporcionará además la posibilidad de manipular el sistema inmune (tanto in vivo como ex vivo) con el fin de controlar infecciones y otras enfermedades.

Los genes localizados en el locus MHC humano (locus HLA) codifican un conjunto de proteínas de membrana altamente polimórficas que incorporan péptidos en compartimentos intracelulares y presentan dichos epítopos peptídicos a receptores específicos de antígeno (TCR) en las células T. El extenso polimorfismo genético de este locus es la base para la huella genética única del sistema inmune en individuos y define el repertorio de epítopos peptídicos antigénicos que la población humana es capaz de reconocer y a los que responder. Así, las moléculas HLA son jugadores clave para determinar la penetrancia y diseminación de enfermedades humanas. Las moléculas MHC de otras especies de vertebrados superiores ejercen funciones biológicas idénticas a las descritas para HLA en el ser humano.

Para incitar una respuesta completa y adecuada, el sistema inmune adquiere, además de la transducción de la señal que resulta de la interacción específica de péptido de las moléculas MHC y TCR (señal 1) , también estímulos por la unión de otras moléculas denominadas co-estimuladoras (señal 2) . Ambos grupos de ligandos inmunoactivadores se unen a sus contra receptores específicos con baja afinidad. Por ejemplo, se ha medido que la interacción monovalente MHC-TCR tiene una constante de afinidad de 10μM con una vida media correspondiente a pocos minutos. La interacción entre CD28 en células T y las moléculas co-estimuladoras en las células presentadoras de antígeno tiene una afinidad del mismo nivel. La baja afinidad intrínseca ha sido un factor significativo que ha limitado el análisis cuantitativo de las interacciones específicas que se requieren para las respuestas inmunes específicas.

Una tecnología establecida recientemente para producir complejos de de tetrámeros MHC solubles, reportada en primer lugar por Davis y colaboradores en 1996 (ref. 1, Science 274, 94-96 (1996) ) ha proporcionado una herramienta para el análisis y detección de la interacción específica entre moléculas MHC y TCR específicas de epítopo en células T en determinadas aplicaciones. Los tetrámeros resultan de moléculas MHC Clase I biotiniladas plegadas en la presencia de un determinante peptídico específico antes de entrecruzarse con estreptavidina. Hasta ahora, se han establecido varios ensayos in vitro e in vivo (ensayo de dilución limitada, ensayo de proliferación, actividad citoquina o citotóxica, ELISPOT y citometría de flujo) para monitorizar respuestas de células T citotóxicas frente a cánceres, enfermedades infecciosas y auto-antígenos. Aunque todavía permanece por definirse la más útil de estas estrategias para predecir la eficacia clínica, por ejemplo, de vacunas de cáncer, existe una alta expectación en el campo acerca del potencial de los tetrámeros. En una estrategia alternativa desarrollada más recientemente, el grupo de Schneck usó inmunoglobulina como un soporte molecular para producir un complejo péptido divalente-MHC-IgG (ref. 2) . Numerosos reportes han mostrado que ambos tipos de complejos MHC oligovalentes se unen a células T específicas de antígeno. Se ha demostrado que dichas estrategias son valiosas para usos científicos, prácticos o clínicos.

Sin embargo, los descubrimientos reportados previamente todavía dejan espacio para la mejora. Muchas moléculas MHC son compuestos lábiles que no son fáciles de obtener, necesitan plegarse correctamente para ser funcionales, y tienen una afinidad de unión intrínseca baja para los TCR lo que hace difícil obtener una interacción suficiente con el TCR. Estos obstáculos con los efectos combinados de éstos han resultado en una utilización limitada de la tecnología y usos de multímeros de MHC en muchos laboratorios. Los reportes previos sólo han demostrado la unión de complejos multi-valentes que consisten en 2-4 moléculas MHC de Clase I o II específicas de epítopos peptídicos. La unión de dichos complejos multi-valentes sólo permite la detección de clones de células T de alta afinidad, es decir, excluye una variedad de clones de células T que responden específicamente, por ejemplo, frente a epítopos subdominantes péptido/MHC.

Muchas técnicas, como, por ejemplo, citometría de flujo. ELISA o electroforesis, usan tejido homogeneizado, células o fragmentos celulares. En muchas aplicaciones, sin embargo, es una ventaja importante ser capaz de identificar y estudiar las dianas potenciales en su entorno y alrededores nativos, es decir, en muestras en las que se conserva la morfología. Sin embargo, esto presenta una alta exigencia para los medios usados en la determinación. Los medios deben ser capaces de unirse a la diana de interés... [Seguir leyendo]

1. Una construcción de moléculas MHC en forma soluble en un medio de solubilización o inmovilizada en un soporte sólido o semi-sólido, comprendiendo dicha construcción de moléculas MHC una molécula vehicular dextrano soluble unida al menos a 5 moléculas MHC, en el que dichas moléculas MHC están unidas a la molécula vehicular dextrano mediante más de una entidad de unión, en el que cada entidad de unión está unida a de 2 a 4 moléculas MHC.

2. Una construcción de moléculas MHC en forma soluble en un medio de solubilización o inmovilizada en un soporte sólido o semi-sólido, comprendiendo dicha construcción de moléculas MHC una molécula vehicular dextrano soluble unida al menos a 5 moléculas MHC, en el que dichas moléculas MHC están unidas directamente a la molécula vehicular dextrano y dicha construcción de moléculas MHC comprende uno o más marcadores.

3. La construcción de moléculas MHC según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que la molécula MHC es una molécula MHC sin péptido o una molécula MHC rellena con péptido.

4. La construcción de moléculas MHC según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que las moléculas MHC son iguales o al menos dos de las moléculas MHC son diferentes.

5. La construcción de moléculas MHC según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que los péptidos portados por las moléculas MHC son iguales o al menos dos de los péptidos portados por las moléculas MHC son diferentes.

6. La construcción de moléculas MHC según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 5, en la que las moléculas MHC están unidas a la molécula vehicular mediante dos o más entidades de unión idénticas, o combinaciones de una o más entidades de unión diferentes.

7. La construcción de moléculas MHC según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 6, en la que la entidad de unión se selecciona de estreptavidina, y derivados de ésta, avidina y derivados de ésta, biotina, inmunoglobulinas, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos recombinantes, fragmentos de anticuerpo y derivados de éstos, dominio de cremallera de leucina de AP-1, jun, fos, hexa-his, hexa-hat glutatión S-transferasa, afinidad de glutatión, péptido de unión a calmodulina, Strep-tag, Dominio de Unión a Celulosa, Proteína de Unión a Maltosa, Etiqueta S-Péptido, Etiqueta de Unión a Quitina, Epítopos Inmunoreactivos, Etiquetas de Epítopo, Etiqueta E2, Etiqueta de Epítopo HA, Epítopo Myc, Epítopo FLAG, Epítopos AU1 y AU5, Epítopo Glu-Glu, Epítopo KT3, Epítopo IRS, Epítopo Btag, Epítopo de Proteína Quinasa C, Epítopo VSV, lecitinas que median la unión a una diversidad de compuestos, incluyendo carbohidratos, lípidos y proteínas, preferiblemente ConA o WGA y tetranectina o Proteína A y Proteína G.

8. La construcción de moléculas MHC según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además una o más moléculas biológicamente activas.

9. La construcción de moléculas MHC según la reivindicación 8, en la que las moléculas biológicamente activas están unidas a la molécula vehicular bien directamente o mediante una o más de las entidades de unión.

10. La construcción de moléculas MHC según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, en la que la molécula biológicamente activa se selecciona de

(a) Proteínas del grupo de proteínas semejantes a MHC Clase I como MIC A, MIC B, CD1d, HLA E, HLA F, HLA G, HLA H, ULBP-1, ULBP-2, y ULBP-3;

(b) moléculas co-estimuladoras del grupo de CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD9, CD27, CD28, CD30, CD69, CD134, CD137, CD147, CDw150, CD152, CD153, CD40L, NKG2D, ICOS, HVEM, HLA Clase II, PD-1, Fas, FasL expresado en células T y/o NK, CD40, CD48, CD58, CD70, CD72, B7.1, B7.2, B7RP-1, B7-H3, PD-L1, PD-L2, CD134L, CD137L, ICOSL, LIGHT expresado en APC y/o células tumorales;

(c) moléculas que modulan células del grupo de CD16, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80, 2B4, KIR, LIR, CD94/NKG2A, CD94/NKG2C expresado en células NK, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL7, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, factores estimuladores de colonias, vitamina D3, toxinas IL-2, ciclosporina, FK-506, rapamicina, TGF-beta, clotrimazol, nitrendipina, y caribdotoxina;

(d) moléculas auxiliares del grupo LFA-1, CD11a/18, CD54, CD106 y CD49a, b, c, d, e, f/CD29;

(e) moléculas de adhesión del grupo de ICAM-1, ICAM-2, GIyCAM-1, CD34, anti-LFA-1, anti-CD44, anti-beta7, quimioquinas, CXCR4, CCR5, anti-selectina L, anti-selectina E, y anti-selectina P;

(f) moléculas tóxicas seleccionadas del grupo de ciclofosfamida, metotrexato, Azatioprina, mizoribina, 15desoxuspergualina, neomicina, estaurosporina, genesteína, herbimicina A, exotoxina A de Pseudomonas, saporina, Rituxán, Ricina, gemtuzumab ozogamicina, toxina Shiga, metales pesados, mercuriales inorgánicos, mercuriales orgánicos, FN18-CRM9, radioisótopos, isótopos incorporados de yodo, isótopos incorporados de cobalto, isótopos incorporados de selenio, isótopos incorporados de tritio, isótopos incorporados de fósforo, haptenos, DNP, y

digoxiginina; y anticuerpos frente a cualquier molécula en (a) - (f) , derivados de dichos anticuerpos y fragmentos de dichos anticuerpos, y combinaciones de éstos y

(g) proteínas, moléculas co-estimuladoras, moléculas que modulan las células, receptores, moléculas auxiliares, moléculas de adhesión, ligandos naturales, y moléculas tóxicas, y anticuerpos y moléculas de unión recombinantes de éstos, y combinaciones de éstos.

11. La construcción de moléculas MHC según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que comprende además uno o más compuestos marcadores.

12. La construcción de moléculas MHC según la reivindicación 11, en la que uno o más compuestos marcadores están unidos a la molécula vehicular y/o una o más de las entidades de unión y/o una o más moléculas MHC.

13. La construcción de moléculas MHC según la reivindicación 11 ó 12, en la que el compuesto marcador es detectable directamente o indirectamente.

14. La construcción de moléculas MHC según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en la que el compuesto marcador se

(a) selecciona de marcadores fluorescentes del grupo de 5-y 6-carboxifluoresceína, 5-ó 6-carboxifluoresceína, ácido 6-fluorescein-5-y 6-carboxamido hexanoico, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, agentes de tinción, Cy2, Cy3, y Cy5, cumarina sustituida opcionalmente, AMCA, PerCP, ficobiliproteínas, Rficoeritrina, aloficoeritrina, Rojo Texas, Rojo Princeston, proteína verde fluorescente y análogos de ésta, conjugados de R-ficoeritrina, conjugados de aloficoeritrina y Cy5 o Rojo Texas, marcadores fluorescentes inorgánicos basados en nanocristales semiconductores, quantum-dot, y marcadores fluorescentes de tiempo resuelto basados en lantánidos, marcadores fluorescentes de tiempo resuelto basados en Eu3+ y marcadores fluorescentes de tiempo resuelto basados en Sm3+;

(b) selecciona de haptenos del grupo de DNP, biotina, y digoxiginina;

(c) selecciona de marcadores enzimáticos del grupo de peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, betagalactosidasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, beta-N-acetil-glucosaminidasa, β-glucuronidasa, invertasa, Xantina Oxidasa, luciferasa de luciérnaga y glucosa oxidasa;

(d) selecciona de marcadores luminiscentes del grupo de luminol, isoluminol, ésteres de acridinio, 1, 2-dioxoetanos y piridopiridazinas; y

(e) selecciona de marcadores radiactivos del grupo de isótopos incorporados de yodo, isótopos incorporados de cobalto, isótopos incorporados de selenio, isótopos incorporados de tritio, e isótopos incorporados de fósforo y

(f) selecciona de un marcador fluorescente, un marcador enzimático, un radioisótopo, un marcador quimioluminiscente, un marcador bioluminiscente, un polímero, una partícula de metal, un hapteno, un anticuerpo, o un agente de tinción.

15. La construcción de moléculas MHC según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, inmovilizada directamente en el soporte sólido o semi-sólido.

16. La construcción de moléculas MHC según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, inmovilizada en el soporte sólido o semi-sólido mediante un conector, un espaciador, o un anticuerpo, un derivado de anticuerpo o un fragmento de éste.

17. La construcción de moléculas MHC según una cualquiera de las reivindicaciones15 a 16, en la que el soporte se selecciona del grupo que consiste en partículas, lechos, partículas biodegradables, láminas, geles, filtros, membranas, membranas de nilón, fibras, capilares, agujas, tiras de microtitulación, tubos, placas o pocillos, peines, puntas de pipeta, micro matrices, chips, portaobjetos, los lechos y partículas son lechos poliméricos, partículas poliméricas, lechos magnéticos, partículas magnéticas, lechos supermagnéticos o partículas supermagnéticas.

18. La construcción de moléculas MHC según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para uso en un método de citometría de flujo, un método histológico o un método citológico.

19. Una composición que comprende una construcción de moléculas MHC según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

20. La composición según la reivindicación 19, en la que la construcción de moléculas MHC comprende moléculas MHC llenas de péptido o moléculas MHC sin péptido; y en la que dichos péptidos para llenar las moléculas MHC sin péptido, y la construcción de moléculas MHC que comprende moléculas MHC sin péptido se proporcionan separadamente.

21. La composición según la reivindicación 19 que comprende además una o más moléculas biológicamente activas y/o excipientes.

22. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 para uso en el tratamiento, prevención, estabilización, o alivio de una enfermedad que implica células que reconocen MHC.

23. La composición según la reivindicación 22, en la que la enfermedad tiene origen inflamatorio, auto-inmune, alérgico, viral, canceroso, infeccioso, alogénico, xenogénico, injerto frente a huésped, huésped frente a injerto, enfermedad inflamatoria crónica del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, esclerosis, diabetes tipo I, artritis reumatoide, psoriasis, dermatitis atópica, asma, melanoma maligno, carcinoma renal, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer del útero, cáncer prostático, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello, leucemia, linfoma cutáneo, carcinoma hepático, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, enfermedad relacionada con el rechazo, enfermedad de injerto frente a huésped, una enfermedad viral asociada con hepatitis, SIDA, sarampión, viruela, varicela, rubéola o herpes.

24. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23 formulada para administración parenteral, incluyendo administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, epicutánea/transdérmica, e intraperitoneal, y para infusión.

25. Uso de la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24 para la fabricación de un medicamento para regular al alza, regular a la baja o modular una respuesta inmune en un animal, para inducir anergia de una célula o para inmunoterapia celular adoptiva.

26. Un método para obtener células que reconocen MHC que comprende poner en contacto una construcción de moléculas MHC según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y una muestra que se sospecha que comprende células que reconocen MHC en condiciones mediante las cuales las células que reconocen MHC se unen a la construcción de moléculas MHC, y aislar la construcción de moléculas MHC y las células que reconocen MHC unidas.

27. El método según la reivindicación 26, en el que el aislamiento se lleva a cabo aplicando un campo magnético o por citometría de flujo.

28. Un método para producir una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24, que comprende proporcionar una construcción de moléculas MHC como se define en las reivindicaciones 1 a 18, solubilizar o dispersar la construcción de moléculas MHC en un medio adecuado para sustancias terapéuticas, y opcionalmente añadir otros excipientes.

Un método para detectar o monitorizar la presencia de células que reconocen MHC en una muestra que comprende las etapas de

(a) poner en contacto una muestra que se sospecha que comprende células que reconocen MHC con una construcción de moléculas MHC según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, y

(b) determinar cualquier unión de la construcción de moléculas MHC, unión que indica la presencia de células que reconocen MHC.

30. Un método para establecer un pronóstico de una enfermedad, determinando el estado de una enfermedad o diagnosticando una enfermedad que implica células que reconocen MHC que comprende las etapas de

(a) poner en contacto una muestra que se sospecha que comprende células que reconocen MHC con una construcción de moléculas MHC según las reivindicaciones 1 a 18, y

(b) determinar cualquier unión de la construcción de moléculas MHC, estableciendo de esta manera un pronóstico de una enfermedad, determinando el estado de una enfermedad o diagnosticando una enfermedad que implica células que reconocen MHC.

31. Un método para determinar la eficacia de un medicamento frente a una enfermedad que implica células que reconocen MHC que comprende las etapas de

(a) poner en contacto una muestra de un sujeto que recibe tratamiento con un medicamento con una construcción de moléculas de MHC según las reivindicaciones 1 a 18, y

(b) determinar cualquier unión de la construcción de moléculas MHC, determinando de esta manera la eficacia del medicamento.

32. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, en el que las células que reconocen MHC están implicadas en una enfermedad de origen inflamatorio, auto-inmune, alérgico, viral, canceroso, infeccioso, alogénico, xenogénico, huésped frente a injerto, injerto frente a huésped o una enfermedad inflamatoria crónica del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, esclerosis, diabetes tipo I, artritis reumatoide, psoriasis, dermatitis atópica, asma, melanoma maligno, carcinoma renal, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer del útero, cáncer cervical, cáncer prostático, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello, leucemia, linfoma cutáneo, carcinoma hepático,

cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, enfermedad relacionada con el rechazo, enfermedad relacionada con injerto frente a huésped, enfermedad viral asociada con hepatitis, SIDA, sarampión, viruela, varicela, rubéola o herpes.

33. El método según la reivindicación 29 a 32, en el que las células que reconocen MHC se seleccionan de subpoblaciones de células T CD3+, células T gamma, delta, células T alfa, beta, células T CD4+, células T auxiliares, células T CD8+, células T supresoras, células T citotóxicas CD8+, CTL, células NK, células NKT, células LAK, y MAK.

34. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 33, en el que la muestra se selecciona del grupo que consiste en material histológico, material citológico, tumores primarios, metástasis orgánicas secundarias, aspirados con aguja fina, tejido del bazo, muestras de médula ósea, extensiones celulares, muestras citológicas exfoliativas, preparaciones por impronta, frotis orales, frotis laríngeos, frotis vaginales, lavado bronquial, lavado gástrico, una muestra del cordón umbilical, una muestra de fluido corporal, una muestra de sangre, una muestra de una población de células mononucleares de sangre periférica aislada de la sangre, una muestra de una preparación derivada de la sangre, una muestra de un producto de leucoféresis, muestras de esputo, expectorados, aspirados bronquiales, biopsias y secciones de biopsias.

35. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 34, en el que la determinación de la unión se lleva a cabo por inspección en un microscopio, por luz, por fluorescencia, por transmisión de electrones, o por citometría de flujo.

36. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 35, en el que la muestra se monta en un soporte, un soporte sólido o semi-sólido o en portaobjetos de vidrio, placas de microtitulación que tienen uno o más pocillos, lechos, partículas, membranas, filtros, membranas de filtro, portaobjetos poliméricos, membranas poliméricas, portaobjetos con cámara, placas, y placas petri.

37. Un método para fabricar la composición según la reivindicación 19 que comprende las etapas de

(i) proporcionar al menos 5 moléculas MHC;

(ii) proporcionar una molécula vehicular dextrano;

(iii) proporcionar más de una entidad de unión;

(iv) unir dichas al menos 5 moléculas MHC a dicho vehículo dextrano mediante dichas más de una entidad de unión; en el que la unión resulta en que cada entidad de unión se una a de 2 a 4 moléculas MHC;

(v) opcionalmente unir una o más moléculas biológicamente activas a dicho vehículo dextrano bien directamente o mediante dicha más de una entidad de unión;

(vi) opcionalmente unir uno o más compuestos marcadores a dicha molécula vehicular dextrano, o a una o más de dichas más de una entidad de unión o a una o más de dichas al menos 5 moléculas MHC;

y fabricar de esta manera la composición según la reivindicación 19.

38. El método según la reivindicación 26, las células que reconocen MHC se obtienen poniendo una muestra de un sujeto que comprende células que reconocen MHC en contacto con una construcción de moléculas MHC según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, mediante lo cual las células que reconocen MHC se unen a la construcción de moléculas MHC, aislando la construcción de moléculas MHC unida y las células que reconocen MHC, y opcionalmente expandiendo ex vivo dichas células que reconocen MHC hasta un número clínicamente relevante y en el que las células que reconocen MHC aisladas se liberan de la construcción de moléculas MHC antes de la expansión.

39. El método según cualquiera de las reivindicaciones 26 ó 38, en el que la construcción de moléculas MHC se inmoviliza en el soporte sólido o semi-sólido antes de o después del contacto con la muestra.

40. El método según cualquiera de las reivindicaciones 38 a 39, en el que la expansión se lleva a cabo en presencia de una o más construcciones de moléculas MHC, opcionalmente una o más moléculas biológicamente activas y opcionalmente células alimentadoras tales como células dendríticas o células alimentadoras.

Figura 36

Antígenos asociados a tumor reconocidos por linfocitos T (fuente: Sociedad de Cáncer Danesa) Proteínas sobre-expresadas en tumores p53, WT1, HER-2/neu, alfa fetoproteína, MUC-1, MUC-2, telomerasa, survinina, FBP Proteínas virales Proteínas HPV (E6 y E7) , EBV (LPM2) Proteínas mutadas, únicas o expresadas aberrantemente CDK-4, P21 ras, MUM-1, MUM-2, MUM-3 (helicasa) , beta-catenina, NA17-A/Gnt-V, p15, pg100-in4, caspasa-8,

hsp70-2, factor de elongación 2, HLA-A2 mutada, miosina clase I, carboxil esterasa intestinal, proteína de fusión BCR-ABL, idiotipo Antígenos de diferenciación específicos de linaje Próstata: PSA, PSMA, PAP Melanoma: tirosinasa, gp100, MART-1, TRP-1, TRP-2, MC1R Antígenos cáncer/testículos Familia MAGE-A: MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12 Familia MAGE-B: MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B6 Familia GAGE: GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8 Familia LAGE: LAGE-1a, LAGE-1b, NY-ESO-1 Miembros separados: BAGE, PRAME (MAPE) , SART-1, SART-3, ART-4