ENLAZADORES MONÓMEROS Y POLÍMEROS ÚTILES PARA CONJUGAR MOLÉCULAS BIOLÓGICAS Y OTRAS SUSTANCIAS.

Un enlazador polimérico lineal que comprende al menos dos unidades consecutivas escogidas entre:

en donde - R1 y R2 se escogen entre NH y O, - R3 se escoge entre metilo, etilo, propilo, CH2OCH2 y (CH2OCH2)2, y en donde el enlazador comprende entre uno y tres grupos etiloxi repetidos de forma consecutiva

La presente invención se refiere a enlazadores monómeros o polímeros útiles en aplicaciones biológicas y químicas, a su síntesis, y a la síntesis y al uso de derivados de los enlazadores conjugados con una variedad de marcadores detectables y otras sustancias. Los enlazadores se pueden utilizar, por ejemplo, junto con marcadores fluorescentes, sondas de ácido nucleico o de análogas de ácido nucleico, y sistemas en fase sólida, y para mejorar la solubilidad de átomos, grupos o moléculas conjugados.

Antecedentes y sumario de la invención

Grandes moléculas y marcadores detectables tales como fluoróforos, matrices o perlas en fase sólida, anticuerpos y sondas de hibridación, se fijan con frecuencia a otras moléculas indirectamente a través de enlazadores, para evitar choques estéricos que podrían disminuir la afinidad entre esas moléculas y sus dianas, reduciendo de este modo su actividad biológica. Un “enlazador” es una molécula que sirve para unir otros átomos, moléculas o grupos funcionales entre sí, a través de interacciones covalentes o no covalentes.

Idealmente, un enlazador puede separar un marcador detectable fijado, de una molécula diana, sin afectar a las propiedades útiles del marcador detectable, tales como su intensidad de señal, su afinidad de la unión o su solubilidad. Sin embargo, en la práctica, numerosas moléculas de enlazadores utilizadas en la técnica tienen una longitud relativamente corta, haciendo difícil el poder evitar choques estéricos entre las sustancias que sirven para la yuxtaposición. Por ejemplo, enlazadores tales como ácido 6-amino-hexanoico, ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil4-(N-maleimidometilo (SMCC) y éster de N-γ-maleimidobutiriloxi succinimida (GMBS); tienen entre 7 y 9 átomos de longitud, que correspondería a aproximadamente 1 nm, si estuvieran completamente extendidos en solución. Esa longitud es solamente una pequeña fracción del tamaño promedio de la macromolécula biológica, tal como una proteína o un oligonucleótido, y puede ser insuficiente para evitar choques estéricos potenciales entre los átomos, los grupos o las moléculas con las que se conjugan esos enlazadores. Otros ejemplos de enlazadores relativamente cortos utilizados en la técnica, incluyen enlazadores homobifuncionales, tales como dialdehído glutárico, divinilsulfona, di-isocianato de hexano, dimetilapimidato, 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno, enlazadores heterobifuncionales, tales como éster de N-gamma-maleimidobutiriloxi-succinimida, y enlazadores de longitud cero, tales como carbodiimida de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropilo).

Moléculas de enlazador más largas basadas en polietilenglicol (PEG) también están disponibles en la técnica. (Véase, por ejemplo, reactivos de modificación Discrete PEG (dPEG)®, disponibles en Quanta Biodesign, Ltd., Powell, OH, o en www.quantabiodesign.com; reactivos a base de PEG disponibles en EMD Biosciences, Inc., San Diego, CA, descritos en el folleto de Novabiochem, de abril de 2004, “Product focus: PEG reagents-bifunctional amino-PEGacid spacers", disponible en www.novabiochem.com; y véase Baumeister y otros, Biopolymers, 71: 339 (2003); Kumar y AIdrich, Org. Lett., 5: 613 (2003). (Véase también, “Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking” Shan

S. Wong, CRC Press, Boca Raton, Florida, EE.UU., 1993; “BioConjugate Techniques” Greg T. Hermanson Academic Press, San Diego, California, EE.UU., 1996; “Catalog of Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation, 2004” Nektar Therapeutics Inc., Huntsville, Alabama, EE.UU). Aunque los enlazadores basados en PEG tienen una longitud más larga, por ejemplo, desde 20 hasta más de 70 átomos, pueden no permanecer siempre extendidos en solución, y en lugar de ello se pueden agregar o formar estructuras terciarias indeseadas. Tal homoagregación o heteroagregación no deseada puede afectar negativamente a la actividad de los átomos, grupos o moléculas conjugados.

La presente invención se define por las reivindicaciones.

Un objeto descrito era encontrar una estructura de enlazador que pudiera adoptar una variedad de longitudes, incluyendo longitudes muy largas, que puede tener una fórmula molecular y estructural bien definida, incluso con longitudes muy largas, que tendría menos tendencia a formar estructuras terciarias indeseadas o agregados, que se podría polimerizar fácilmente y de forma eficaz si se deseara, y que podría hallarse en forma extendida en solución. Los enlazadores descritos pueden permitir que diferentes átomos, grupos o moléculas conjugados se separen con distancias cortas o, por ejemplo, de hasta algunos nanómetros, en solución. Los presentes enlazadores también se pueden diseñar de modo que posean fórmulas moleculares y estructurales bien definidas, proporcionando una mayor uniformidad a las entidades moleculares que las comprenden. En algunas de las presentes realizaciones, incluso enlazadores muy largos según la presente invención, permanecen asombrosamente en una estructura extendida y flexible en soluciones acuosas y tienen una ligera tendencia a plegarse sobre sí mismos, a agregarse entre sí, o a formar otras estructuras terciarias que interfieren con las funciones de los átomos, grupos o moléculas conjugados que son portadores. Algunos de los presentes enlazadores forman cadenas con poco volumen estérico a lo largo de su longitud, y de este modo, pueden acceder fácilmente a espacios moleculares estrechos para interaccionar con superficies en fase sólida o membranas con una densidad elevada. La presente invención también comprende métodos para sintetizar los presentes enlazadores y fijarlos covalentemente a otras moléculas y grupos funcionales con un rendimiento elevado.

Los enlazadores de la presente invención pueden estar fijados de forma covalente o no covalente a una variedad de sustancias que incluyen marcadores de color, componentes de superficies sólidas, ácidos nucleicos y análogos de ácidos nucleicos, proteínas y sustratos de proteínas. La capacidad de algunos de los presentes enlazadores para permanecer extendidos y flexibles en solución, puede minimizar la interferencia estérica entre el enlazador y el átomo, el grupo o la molécula conjugada, de modo que la señal del conjugado o su disponibilidad para ser reconocida por las moléculas diana, está mínimamente perturbada por el enlazador. Así, la presente invención comprende un método para mejorar la intensidad de la señal, la actividad o la afinidad de la unión de una molécula, tal como un marcador detectable, que incluye una sonda, que comprende conjugar la molécula con uno o varios de los presentes enlazadores.

Por ejemplo, cuando las sondas de proteína-ácido nucleico (PNA) se conjugan con los enlazadores, los PNAs son menos susceptibles a la agregación y permanecen más disponibles para unirse a sus secuencias diana destinadas. Además, ya que la estructura de los presentes enlazadores en solución puede ser larga y flexible, los presentes enlazadores se pueden utilizar para reticular moléculas grandes entre sí, de un modo que permita a las moléculas adoptar sus orientaciones preferidas, y de este modo perturbar mínimamente la estructura y la afinidad del complejo molecular.

Como otro ejemplo, el volumen estérico o la estructura terciaria próxima a un marcador fluorescente puede causar una extinción de la fluorescencia debido a la absorbancia de la señal por los enlaces moleculares circundantes. Las interacciones entre dos o varios fluoróforos próximos, también pueden causar la extinción de sus señales. Esto puede ser un problema al diseñar marcadores detectables que comprenden múltiples fluoróforos conjugados. Por ejemplo, en la detección de proteínas, típicamente solamente se pueden añadir aproximadamente 3-4 fluoróforos, antes de alcanzar una meseta en la intensidad de las señales. La adición de otros fluoróforos puede incluso disminuir la señal global. Dicha extinción se puede reducir usando realizaciones de la presente invención. Por consiguiente, esta invención incluye un método para mejorar la señal de uno o de varios fluoróforos, que comprende conjugar uno o varios fluoróforos por lo menos con uno de los presentes enlazadores. Debido a que la extinción debida a la fijación del enlazador de la presente invención, puede ser mínima, y a que los fluoróforos individuales se pueden conjugar de modo que no interfieran significativamente entre sí, los presentes enlazadores también permiten el diseño de derivados de enlazadores con fluoróforos múltiples que tienen colores de emisión predecibles que son una combinación... [Seguir leyendo]

1. Un enlazador polimérico lineal que comprende al menos dos unidades consecutivas escogidas entre:

**(Ver fórmula)**

5 en donde

• R1 y R2 se escogen entre NH y O,

• R3 se escoge entre metilo, etilo, propilo, CH2OCH2 y (CH2OCH2)2, y en donde el enlazador comprende entre uno y tres grupos etiloxi repetidos de forma consecutiva. 2. El enlazador de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende al menos una unidad de Fórmula I en la que R1 y R2 son NH, y R3 es CH2OCH2. 3. El enlazador de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende dos unidades de Fórmula I, de fórmula:

**(Ver fórmula)**

4. El enlazador de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende tres unidades de Fórmula I, de fórmula:

**(Ver fórmula)**

15 5. El enlazador de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende cuatro unidades de Fórmula I, de fórmula: 6. El enlazador de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende seis unidades de Fórmula I, de fórmula:

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

7. El enlazador de acuerdo con las reivindicaciones 3-6, en donde cada R1 y R2 se escogen individualmente entre NH y O, y en donde cada R3 se escoge individualmente entre metilo, etilo, propilo, CH2OCH2 y (CH2OCH2)2.

8. Un derivado de enlazador que comprende un enlazador de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, conjugado con al menos un átomo, un grupo funcional o una molécula.

9. El derivado de enlazador de acuerdo con la reivindicación 8, en el que al menos un átomo, un grupo funcional o una molécula comprende al menos un marcador detectable o al menos una sonda.

10. El derivado de enlazador de acuerdo con la reivindicación 9, en donde al menos un átomo, un grupo funcional o una molécula comprende al menos un marcador detectable y en donde al menos un marcador detectable comprende al menos un marcador de color.

11. El derivado de enlazador de acuerdo con la reivindicación 10, en donde al menos un marcador de color comprende al menos un fluoróforo.

12. El derivado de enlazador de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende dos o varios fluoróforos con la misma longitud de onda o con longitudes de onda de emisión diferentes y distinguibles.

13. El derivado de enlazador de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende al menos un ácido nucleico o al menos un análogo de ácido nucleico.

14-El derivado de enlazador de acuerdo con la reivindicación 13, en donde al menos un análogo de ácido nucleico comprende PNA.

15-El derivado de enlazador de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el enlazador se fija adicionalmente de forma covalente o no covalente a al menos una superficie sólida.

16-El derivado de enlazador de acuerdo con la reivindicación 15, en donde al menos una superficie sólida es dextrano.

17. El derivado de enlazador de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende un marcador detectable, una sonda, un ácido nucleico o un análogo de ácido nucleico, y/o una superficie sólida separadas entre sí por enlazado-res que comprenden entre cuatro y diez unidades consecutivas de la Fórmula I.

18. Un método para mejorar la intensidad de la señal, la actividad, la afinidad de la unión o la solubilidad acuosa de una molécula, que comprende conjugar la molécula con un enlazador de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde la molécula comprende al menos un marcador detectable o una sonda.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde la molécula comprende al menos un marcador detectable y en donde al menos un marcador detectable comprende al menos un marcador de color.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde al menos un marcador de color comprende un fluoróforo.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde la molécula comprende al menos un ácido nucleico o un análogo de ácido nucleico.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 22, en donde al menos un análogo de ácido nucleico comprende el PNA.

24. El método para amplificar una señal procedente de un cambio en un sistema molecular, que comprende detectar dicho cambio con al menos un derivado de enlazador de acuerdo con la reivindicación 8.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 24, en donde el derivado de enlazador comprende al menos un marcador de color.

26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde al menos un marcador de color comprende un fluoróforo.

27. Un método de acuerdo con la reivindicación 26, en donde el derivado de enlazador comprende al menos dos fluoróforos con la misma longitud de onda o con longitudes de onda de emisión diferentes y distinguibles, en donde cada fluoróforo está separado de los otros fluoróforos del derivado de enlazador por un enlazador que comprende entre cuatro y diez unidades consecutivas de la Fórmula I.

28. Un sistema que comprende al menos dos derivados de enlazadores, en donde cada enlazador es un enlazador de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, y en donde el primer derivado de enlazador comprende al menos un fluoróforo y un ácido nucleico o un análogo de ácido nucleico; y en donde el segundo derivado de enlazador comprende una proteína o una superficie sólida y un ácido nucleico o un análogo de ácido nucleico.

29. El sistema de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el análogo de ácido nucleico es PNA.

30. El sistema de acuerdo con la reivindicación 29, en donde el ácido nucleico o los análogos de ácido nucleico del primer y del segundo derivado de enlazador son capaces de hibridarse entre sí.

31. El sistema de acuerdo con la reivindicación 30, en donde el primer derivado de enlazador se conjuga con al menos un fluoróforo y un PNA; y en donde la proteína o la superficie sólida del segundo derivado de enlazador es un anticuerpo, un antígeno y/o dextrano; y en donde el PNA del primer derivado de enlazador y el PNA del segundo derivado de enlazador son capaces de hibridarse entre sí.

32. El sistema de acuerdo con la reivindicación 28, que comprende tres derivados de enlazadores.

33. El sistema de acuerdo con la reivindicación 29, que comprende teres derivados de enlazadores.

34. El sistema de acuerdo con la reivindicación 29, en donde el primer y el segundo derivado de enlazador no son capaces de hibridarse entre sí, y en donde el tercer derivado de enlazador comprende al menos un PNA que reconoce secuencias del PNA sobre cada uno del primero y del segundo derivados de enlazadores.