REACTIVO DE LIBERACIÓN PARA COMPUESTOS DE VITAMINA D.

La presente invención se refiere a una composición reactivo para la liberación de los compuestos de vitamina D unidos a una proteína de unión de la vitamina D, un método para detectar un compuesto de 25-hidroxivitamina D, en el cual el compuesto 25-hidroxivitamina D, es liberado de la proteína de unión de la vitamina D, mediante el empleo de este reactivo, y la mezcla obtenida de esta manera se analiza. Se refiere también al empleo del reactivo para liberar los compuestos de vitamina D, así como también un kit para detectar la 25-hidroxivitamina D el cual contiene el reactivo para la liberación de los compuestos de vitamina D, además de reactivos inmunológicos comunes. Un suministro adecuado de vitamina D es vital, como ya sugiere el mismo término de "vitamina". Una deficiencia de vitamina D conduce a graves enfermedades tales como el raquitismo o la osteoporosis. Así como la vitamina D se consideraba todavía como una sola substancia al principio del último siglo, el sistema de la vitamina D ha cambiado en el curso de las últimas tres décadas en una compleja y múltiple red de metabolitos de la vitamina D. Actualmente se conocen más de 40 diferentes productos metabólicos de la vitamina D (Zerwekh, J.E., Ann. Clin. Biochem. 41 (2004) 272-281). Los seres humanos pueden producir solamente vitaminas D3 ó calciferoles mediante la acción de los rayos ultravioleta de la luz del sol sobre la piel. La vitamina D3 que se produce en la piel se une a la llamada proteína de unión de la vitamina D, la cual la transporta al hígado en donde se convierte en la 25-hidroxivitamina D3 mediante la 25-hidroxilación. Se sabe actualmente que una multitud de otros tejidos están involucrados en el metabolismo de la vitamina D además de la piel y el hígado, los dos órganos que ya han sido mencionados (véase Schmidt-Gayk, H. et al. (editores), "Calcium regulating hormones, vitamina D metabolites and cyclic AMP" ("Hormonas reguladoras del calico, metabolitos de la vitamina D y AMP cíclico"), Springer Verlag, Heidelberg (1990), páginas 24-47. La 25hidroxivitamina D y más específicamente la 25-hidroxivitamina D2 y la 25-hidroxivitamina D3 son la forma central de almacenamiento de la vitamina D en el organismo humano con respecto a sus cantidades. Cuando es necesario, estos precursores pueden transformarse en los riñones para formar la 1,25-hidroxivitamina D biológicamente activa, la llamada hormona D. La vitamina D biológicamente activa regula entre otras cosas la absorción del calcio a partir del intestino, la mineralización de los huesos e influye sobre un gran número de otras vías metabólicas como por ejemplo, el sistema de la insulina. La medición del nivel de vitamina D es por sí misma poco significativa cuando se determina el estatus de la vitamina D de un paciente, debido a que las concentraciones de vitamina D (vitamina D2 y vitamina D3) fluctúan en gran manera en función de la absorción de los alimentos. Además, la vitamina D tiene una relativamente corta semivida biológica en la circulación (24 horas) y por lo tanto no es tampoco por esta razón un parámetro adecuado para la determinación del estatus de la vitamina D de un paciente. Lo mismo sirve también para las formas fisiológicamente activas de vitamina D (1,25-hidroxivitamina D). Estas formas biológicamente activas tienen también lugar en concentraciones relativamente pequeñas y altamente fluctuantes, comparadas con la 25-hidroxivitamina D. Por todas estas razones la cuantificación de la 25-hidroxivitamina D en particular es un medio adecuado para analizar globalmente el estatus total de la vitamina D de un paciente. La unión de la 25-hidroxivitamina D ó de otros compuestos de la vitamina D, a la proteína de unión a la vitamina D, complica enormemente la determinación de los compuestos de vitamina D. Todos los métodos conocidos necesitan que el compuesto de vitamina D que se va a analizar se libere o se separe del complejo que forma con la proteína de unión. En adelante esto recibe el nombre de liberación de un compuesto de vitamina D a partir de la proteína de unión de la vitamina D, en aras de la simplificación, aunque por supuesto sólo puede liberarse a partir de un complejo de un compuesto de vitamina D y de la proteína de unión de la vitamina D, y no a partir de la proteína de unión de la vitamina D, sola. Dado que la proteína de unión de la vitamina D tiene una alta tendencia a replegarse correctamente, es necesario a menudo liberar en primer lugar los compuestos de la vitamina D y a continuación separar la proteína de unión de la vitamina D, de los compuestos de vitamina D que se van a analizar. Debido a la alta importancia clínica de la 25-hidroxivitamina D , se conocen un gran número de métodos a partir de la literatura que permiten que la 25-hidroxivitamina D sea determinada más o menos fiablemente. Haddad, J.G. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 33 (1971) 992-995, y Eisman, J. A. et al., Anal Biochem. 80 (1977) 298-305, describen por ejemplo, la determinación de las concentraciones de la 25-hidroxivitamina D en muestras de sangre, empleando la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Otros métodos para la determinación de la 25-hidroxivitamina D, se basan entre otras cosas en el empleo de las proteínas de unión con la vitamina D, como las que están presentes en la leche. Así, Holick, M.F. y Ray, R. (US 5. 981.779) y DeLuca et al., (EP 0 583 945) describen ensayos de vitamina D para la hidroxivitamina D y la 2   dihidroxivitamina D que se basan en la unión de estas substancias con la proteína de unión de la vitamina D, en donde las concentraciones de estas substancias se determinan por medio de un procedimiento de ensayo competitivo. Sin embargo, un requisito previo de este método, es que los metabolitos de la vitamina D que se determinen tienen que ser en primer lugar aislados de las muestras de sangre o suero originales, y tienen que ser purificados mediante por ejemplo, cromatografía. Armbruster, F.P. et al., (WO 99/67211) describe que para la determinación de la vitamina D debe prepararse una muestra de suero o plasma, mediante precipitación con etanol. En este método el precipitado de proteína se separa por centrifugación y el sobrenadante etanólico contiene los metabolitos solubles de la vitamina D. Estos pueden medirse en un ensayo de unión competitiva. Alternativamente, la patente EP 0 753 743 describe que las proteínas pueden separarse de las muestras de sangre o de suero, empleando una sal de peryodato. En este caso, los compuestos de vitamina D se determinan en el sobrenadante libre de proteína a partir de las muestras tratadas con peryodato. En algunos ensayos comerciales se recomienda el acetonitrilo para la extracción de la muestra de suero o de plasma (por ejemplo, en el ensayo radio inmunológico de DiaSorin o en el ensayo de la vitamina D a partir del "Immundiagnostick" Company). En los últimos años se han propuesto un gran número de distintos reactivos de liberación, los cuales deberían ser en principio adecuados para la liberación de los compuestos de vitamina D a partir de la proteína de unión presente en la muestra. Sin embargo, esta liberación o desprendimiento, debe ser efectuada en condiciones relativamente suaves, permitiendo así un empleo directo de la muestra tratada con el reactivo de liberación en un ensayo de unión (ver por ejemplo la patente WO 02/57797 y US 2004/0132104). A pesar de los inmensos esfuerzos realizados los últimos años, todos los métodos disponibles para la determinación de la vitamina D, presentan desventajas, como por ejemplo la laboriosa preparación de la muestra, una pobre estandarización, una pobre concordancia entre los distintos procedimientos de ensayo o la mala recuperación de las puntas de vitamina D (ver en particular Zerwekh, J.E. más arriba). La patente US 2004/0096900 A1 describe un agente de desplazamiento no competitivo para efectuar la separación de cualquier metabolito de la vitamina D en la muestra a partir de la proteína a la cual está unida. Es particularmente difícil automatizar un ensayo para un compuesto de vitamina D. La automatización requiere la solución de un muy difícil problema, a saber, la supervivencia en una cuerda floja: por una parte es necesario liberar los compuestos de la vitamina D a partir de la proteína de unión de la vitamina D, con ayuda de un agente de liberación adecuado, y por otra parte las condiciones tienen que seleccionarse de forma que la muestra pueda ser además directamente analizada. Un requisito previo de este análisis directo adicional es que por una parte, la proteína de unión de la vitamina D, no se una, o ya no se una con una extensión significativa a los compuestos de vitamina D durante este análisis y así no interfiera con el análisis y por otra parte, que el reactivo de liberación empleado no interfiera con la unión... [Seguir leyendo]

1. Composición reactivo para la liberación de la vitamina D a partir de la proteína de unión con la vitamina D la cual tiene un valor del pH de 3,8 a 4,8 y contiene de un 5 a un 30 por ciento en volumen de uno o más reactivos anfifílicos seleccionados del grupo formado por el sulfóxido de dimetilo (DMSO), la dimetilformamida (DMF), la N,N- dimetilacetamida, la tetrametilurea (TMU), la N-metilpirrolidona (N-MP), la 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2(1H)pirimidona (DMPU) y la triamida del ácido hexametilfosfórico (HMPT), y de un 0,7 a un 8 por ciento en volumen de un alcohol de cadena corta (de 1 a 3 átomos de carbono), seleccionado entre el metanol, el etanol, el propanol, y el isopropanol. 2. Composición reactivo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque, está presente del 7 al 20 por ciento en volumen de reactivo anfifílico. 3. Composición reactivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque, el etanol está presente como un alcohol de cadena corta. 4. Método para la detección inmunológica del compuesto de la 25-hidroxivitamina D la cual comprende los siguientes pasos: a) mezclado de la muestra que se va a investigar, con un reactivo que libera los compuestos de la vitamina D a partir de la proteína de unión con la vitamina D, para formar una mezcla con un valor del pH de 3,8 a 4,8 y que contiene de un 5 a un 20 por ciento en volumen de uno o más reactivos anfifílicos, seleccionados del grupo formado por el sulfóxido de dimetilo (DMSO), la dimetilformamida (DMF), la N,N-dimetilacetamida, la tetrametilurea (TMU), la Nmetilpirrolidona (N-MP), la 1,3-trimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2(1H)-pirimidona (DMPU) y la triamida del ácido hexametilfosfórico (HMPT), y de un 0,5 a un 5 por ciento en volumen de un alcohol de cadena corta (de 1 a 3 átomos de carbono), seleccionado entre el metanol, el etanol, el propanol, y el isopropanol b) análisis inmunológico de la mezcla de a). 5. Método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el compuesto de la 25-hidroxivitamina D se selecciona de la 25-hidroxivitamina D2, la 25-hidroxivitamina D3, la 1,25-dihidroxivitamina D2, y la 1,25-dihidroxivitamina D3. 6. Método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde se determinan los compuestos de la 25-hidroxivitamina D, la 25-hidroxivitamina D2 y la 25-hidroxivitamina D3. 7. Empleo de una composición reactivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, para liberar los compuestos de vitamina D a partir de la proteína de unión con la vitamina D. 8. Empleo de una composición reactivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, para liberar los compuestos de vitamina D a partir de la proteína de unión con la vitamina D, en donde la liberación es independiente del fenotipo de la proteína de unión con la vitamina D. 9. Kit para la detección de la 25-hidroxivitamina D, el cual contiene los componentes para una detección inmunológica de por lo menos un compuesto de 25-hidroxivitamina D, caracterizado porque, este kit contiene adicionalmente una composición reactivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3. 10. Composición reactivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, mezclada con suero o plasma, para formar una mezcla con un valor del pH de 3,8 a 4,8 y que contiene del 5 al 20 por ciento en volumen de uno o más reactivos anfifílicos seleccionados del grupo formado por el sulfóxido de dimetilo (DMSO), la dimetilformamida (DMF), la N,N-dimetilacetamida, la tetrametilurea (TMU), la N-metilpirrolidona (N-MP), la 1,3-trimetil-3,4,5,6- tetrahidro-2(1H)-pirimidona (DMPU) y la triamida del ácido hexametilfosfórico (HMPT), y del 0,5 al 5 por ciento en volumen de un alcohol de cadena corta (de 1 a 3 átomos de carbono), seleccionado entre el metanol, el etanol, el propanol, y el isopropanol. 14     16   17   18   19     21