Ratón transgénico que tiene un fenotipo de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano, usos experimentales y aplicaciones.

Ratón transgénico que tiene genes endógenos no funcionales de H2 clase I y de H2 clase II,

que comprende un transgén funcional de HLA-A2 y un transgén funcional de HLA-DR1, en el que dicho transgén de HLA-A2 es una monocadena que comprende la beta 2 microglobulina humana enlazada covalentemente a la cadena pesada de HLA-A

Ratón transgénico que tiene un fenotipo de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano, usos experimentales y aplicaciones.

Referencia cruzada a solicitud relacionada Esta solicitud se basa en y reivindica los derechos de la Solicitud Provisional US nº 60/490.945, presentada el 30 de julio de 2003 (número de expediente 03495.6093) , sobre la que se basa toda la descripción.

Antecedentes de la invención Actualmente se están desarrollando muchas vacunas para inmunoterapia contra el cáncer humano y para el tratamiento de enfermedades infecciosas, tales como malaria, SIDA, virus de la hepatitis C, y SARS. Dada la rapidez con la que pueden aparecer nuevos patógenos emergentes, es importante mejorar modelos de animales que se pudiesen usar para evaluar rápidamente y de forma fiable las estrategias de vacunación y la capacidad protectora de diferentes epítopos. Además, ya se necesitan estudios in vivo para evaluar variables cruciales del comportamiento de las vacunas que no se evalúan fácilmente o son imposibles de medir in vitro, tales como la inmunogenicidad de las vacunas, la formulación de las vacunas, la vía de administración, la distribución tisular, y la implicación de órganos linfoides primarios y secundarios. Debido a su simplicidad y flexibilidad, los pequeños animales, tales como los ratones, representan una alternativa atractiva a sistemas de modelos más farragosos y caros, tales como primates no humanos, al menos para estudios de desarrollo de vacunas iniciales.

La eficacia moderada observada en varios ensayos clínicos de vacunas, que se encontró que eran protectoras en estudios de animales de tipo salvaje (McMichael, A.J. y Hanke, T. Nat Med 9, 874-880 (2003) ) , se puede explicar parcialmente por la diferente influencia que el MHC humano y animal tiene sobre el resultado de la respuesta inmunitaria, puesto que las moléculas de MHC animal y HLA humano no presentan los mismos epítopos óptimos (Rotzschke, O. et al. Nature 348, 252-254 (1990) ) . De este modo, a pesar de algunas limitaciones, los ratones transgénicos que expresan HLA humano deberían representar una mejora útil con respecto a ratones de tipo salvaje como un modelo preclínico para ensayar candidatos de vacunas, evaluar el riesgo potencial de que las vacunas puedan inducir trastornos autoinmunitarios, y diseñar mejores estrategias terapéuticas basándose en el elemento de restricción humano.

Células T citotóxicas Las células T citotóxicas (CTL) desempeñan un papel crucial en la erradicación de enfermedades infecciosas y, en algunos casos, cáncer (P. Aichele, H. Hengartner, R.M. Zinkernagel y M. Schulz, J Exp Med 171 (1990) , p. 1815; L. BenMohamed, H. Gras-Masse, A. Tartar, P. Daubersies, K Brahimi, M. Bossus, A. Thomas y P. Druhile, Eur J Immunol 27 (1997) , p. 1242; D.J. Diamond, J. York, J. Sun, C.L. Wright y S.J. Forman, Blood 90 (1997) , p. 1751) . Las vacunas de proteínas recombinantes no inducen respuestas de CTL de forma fiable (Habeshaw JA, Dalgleish AG, Bountiff L, Newell AL, Wilks, D, Walker LC, Manca F. 1990 noviembre; 11 (11) : 418-25; Miller SB, Tse H, Rosenspire AJ, King SR. Virology. 1992 diciembre; 191 (2) :9 73-7) . El uso de vacunas de otro modo inmunógenas, que consisten en patógenos atenuados, en seres humanos, está impedido en varias enfermedades importantes, por problemas de seguridad primordiales. En los últimos años recientes, se han propuesto enfoques a base de epítopos como una posible estrategia para desarrollar nuevas vacunas profilácticas e inmunoterapéuticas (Melief CJ, Offringa R, Toes RE, Kast WM. Curr Opin Immunol. 1996 Oct, 8 (5) :651-7; Chesnut RW, Design testing of peptide based cytotoxic T-cell mediated immunotherapeutic to treat infiction disease, cancer, en Ppowell, MF, Newman, MJ (eds.) : Vaccine Design: The Subunit, Adjuvant Approach, Plenum Press, Nueva York 1995, 847) . Este enfoque ofrece varias ventajas, incluyendo la selección de epítopos procesados de forma natural, que fuerza al sistema inmunitario a enfocarse en epítopos de un patógeno muy conservados e inmunodominantes (R.G. van der Most, A. Sette, C. Oseroff, J. Alexander, K. Murali-Krishna, L.L. Lau, S, Southwood, J. Sidney, R.W. Chesnut, M. Matioubian y R. Ahmed, J Immunol 157 (1996) , p. 5543) y la inducción de respuestas multiepitópicas para evitar el escape mediante mutación, tal como se observa en infecciones por VIH, virus de la hepatitis B (HBV) y virus de la hepatitis C (HCV) . Esto permite la eliminación de determinantes de células T supresoras, que pueden provocar preferentemente una respuesta TH2, en condiciones en las que es deseable una respuesta TH1, o viceversa (Pfeiffer C, Murray J, Madri J, Bottomly K. Immunol Rev. 1991 octubre;123:65-84; P Chaturvedi, Q Yu, S Southwood, A Sette, y B Singh Int Immunol 1996 8: 745-755) . Finalmente, proporciona la posibilidad de librarse de determinantes de células T autoinmunes en antígenos, lo que puede inducir enfermedades autoinmunitarias indeseables. La inmunidad antiviral o antitumoral protectora usando péptidos de epítopos de CTL se ha logrado en varios modelos experimentales (D.J. Diamond, J. York, J. Sun, C.L. Wright y S.J. Forman, Blood 90 1997, p. 1751; J.E.J. Blaney, E. Nobusawa, M.A. Brehm, R.H. Bonneau, L.M. Mylin, T.M. Fu, Y. Kawaoka y S.S. Tevethia, J Virol 72 (1998) , p. 9567) .

La definición de epítopo de CTL basándose en el uso de linfocitos humanos puede ser engañosa debido a heterogeneidad medioambiental y genética que conduce a resultados incompletos, y debido a dificultades técnicas en el aislamiento de clones de CTL. Los ratones transgénicos de HLA clase I o clase II descritos hasta la fecha han demostrado ser una herramienta valiosa para superar estas limitaciones, como se ilustra mediante la identificación

con tales modelos de animales de nuevos epítopos de CTL y T auxiliares (Hill AV. Annu Rev Immunol. 1998;16:593617; Carmon L, EI-Shami KM, Paz A., Pascolo S, Tzehoval E, Tirosb B, Koren R, Feldman M, Fridkin M, Lemonnier FA, Eisenbach L. Int J Cancer, 1 febrero de 2000;85 (3) :391-7) . Estos ratones también se han usado para demostrar: i) una buena correlación entre la afinidad de unión de HLA peptídico y la inmunogenicidad (Lustgarten J, Theobald M, Labadie C, LaFace D, Peterson P, Disis ML, Cheaver MA, Sherman LA. Hum Immunol. 1997 febrero;52 (2) :10918; Bakker AB, van der Burg SH, Huijbens RJ, DRijfhout JW, Melief CJ, Adema GJ, Figdor CG. Int J Cancer. 27 de enero de 1997;70 (3) :302-9) , ii) el solapamiento significativo entre el sistema de CTL murino y humano al nivel de procesamiento antigénico (se generan los mismos epítopos) , y iii) la movilización comparable frente a la mayoría de los antígenos de los repertorios de CTL en ratones transgénicos de HLA y humanos (Wentworth, P. A., A. Vifiello, J. Sidney, E. Keogh, P, W. Chesnut, H. Grey, A. Sette. 1996. Eur. J. Immunol. 26:97; Alexander, J., C. Oserof, J. Sidney, P. Wentworth, E. Keogh, G. Hermanson, F. V. Chisari R. T, Kubo, H. M, Grey, A, Sette, 1997. J.Immunol. 159:4753) .

Hasta la fecha, se han desarrollado vacunas sintéticas de epítopos de CTL a base de péptidos como agentes inmunoterapéuticos frente a un número de enfermedades humanas [18-20]. Sin embargo, sólo se observó una eficacia moderada en varios ensayos clínicos (21) . Esto se puede explicar en parte por el fracaso de estas vacunas para inducir respuestas de CTL suficientemente potentes. De hecho, informes recientes sugieren la necesidad de la ayuda de células T CD4+ para obtener una respuesta de CTL máxima (A.J. Zajac, K. Murali-Krishna, J.N. Blattman y R. Ahmed, Curr Opin Immunol 10 (1998) , p. 444; Firat H, Garcia-Pons F, Tourdot S, Pascolo S, Scardino A, Garcia Z, Michel ML, Jack RW, Jung 0, Kosmatopoulos K, Mateo L, Suhrbier A, Lemonnier FA, Langlade-Dernoyen P Eur J Irmnunol 29, 3112, 1999) .

CTL son componentes críticos de la inmunidad protectora frente a infecciones víricas, pero no se comprenden completamente los requisitos para el cebado in vivo de CTL. Ahora se acepta que las células Th son normalmente esenciales para el cebado de CTL con péptidos sintéticos. Con respecto a péptidos epitópicos de CTL sintéticos, varios estudios señalan una necesidad imperiosa de la estimulación de linfocitos Th para inducir respuestas de CTL óptimas (C. Fayolle, E. Deriaud y C. Leclerc, J Immunol 147 (1991) , p, 4069; C. Widmann, P. Romero, J.L. Mar y anski, G. Corradin y D. Valmori, J Immunol Meth 155 (1992) , p. 95; M. Shirai, C.D. Pendkton, J. Ahlers, T. Takeshita, M. Newman y J.A. Berzofsky, J Immunol 152 (1994) , p. 549; J.P. Sauet, H. Gras-Masse, J.G. Guillet y E. Gomard, Int Immunol 8 (1996) . p. 457) . Varios de estos estudios mostraron que la activación de una célula T CD8+ requiere... [Seguir leyendo]

1. Ratón transgénico que tiene genes endógenos no funcionales de H2 clase I y de H2 clase II, que comprende un transgén funcional de HLA-A2 y un transgén funcional de HLA-DR1, en el que dicho transgén de HLA-A2 es una monocadena que comprende la beta 2 microglobulina humana enlazada covalentemente a la cadena pesada de HLA-A2.

2. Ratón transgénico según la reivindicación 1, en el que el transgén de HLA-A2 comprende la secuencia de HLA-A2

proporcionada en el listado de secuencias en SEC ID nº 1, y el transgén de HLA-DR1 comprende la secuencia de 10 HLA-DR1 proporcionada en el listado de secuencias en SEC ID nº 2 y SEC ID nº 3.

3. Método para identificar simultáneamente la presencia de uno o más epítopos en un antígeno o grupo de antígenos candidatos, en el que el epítopo provoca una respuesta humoral específica, una respuesta restringida a HLA-DR1 de TH, y/o una respuesta restringida a HLA-A2 de CTRL, comprendiendo el método:

a) administrar el antígeno candidato o grupo de antígenos candidatos al ratón de la reivindicación 1 o 2; b) analizar una respuesta humoral específica en el ratón frente al antígeno; c) analizar una respuesta restringida a HLA-DR1 de TH en el ratón frente al antígeno; y d) analizar una respuesta restringida a HLA-A2 de CTRL en el ratón frente al antígeno;

en el que la observación de una respuesta humoral específica en el ratón frente al antígeno identifica un epítopo que provoca una respuesta humoral en el antígeno;

la observación de una respuesta restringida a HLA-DR1 de TH en el ratón frente al antígeno identifica un epítopo que provoca una respuesta restringida a HLA-DR1 de TH en el antígeno; y la observación de una respuesta restringida a HLA-A2 de CTRL en el ratón frente al antígeno identifica un epítopo 30 que provoca una respuesta restringida a HLA-A2 de CTRL en el antígeno.

4. Método según la reivindicación 3, que comprende además analizar una respuesta específica de Th1 en el ratón frente al antígeno y analizar una respuesta específica de Th2 en el ratón frente al antígeno; en el que

la observación de una respuesta específica de Th1 en el ratón frente al antígeno identifica un epítopo que provoca una respuesta específica de Th1 en el ratón frente al antígeno; y la observación de una respuesta específica de Th2 en el ratón frente al antígeno identifica un epítopo que provoca una respuesta específica de Th2 en el ratón frente al antígeno. 40

5. Método para identificar la presencia de un epítopo en un antígeno candidato o grupo de antígenos candidatos, comprendiendo el método:

a) administrar el antígeno candidato o grupo de antígenos candidatos al ratón de la reivindicación 1 o 2; y 45 b) analizar la respuesta epitópica en el ratón frente al antígeno; en el que la observación de una respuesta epitópica T auxiliar restringida a HLA-DR1 de TH identifica un epítopo T auxiliar restringido a HLA-DR1 en el antígeno, y 50 la observación de una respuesta epitópica T citotóxica (CTL) restringida a HLA-A2 identifica un epítopo T citotóxico (CTL) restringido a HLA-A2 en el antígeno.

6. Método para comparar la eficacia de una respuesta inducida por dos o más vacunas, comprendiendo el método:

55 a) administrar una primera vacuna candidata a un ratón de la reivindicación 1 o 2 y medir la respuesta inducida en el ratón por la primera vacuna candidata;

b) administrar una segunda vacuna candidata a un ratón de la reivindicación 1 o 2 y medir la respuesta inducida en el ratón por la segunda vacuna candidata; 60 c) administrar cada vacuna candidata adicional a comparar a un ratón de la reivindicación 1 o 2 y medir la respuesta inducida en el ratón por cada vacuna candidata adicional a comparar; y d) determinar la eficacia de cada vacuna candidata para inducir una respuesta comparando las respuestas con 65 cada una de las vacunas a comparar entre sí, en el que dicha respuesta es una respuesta de célula T auxiliar, una respuesta de célula citotóxica o ambas.

7. Método según la reivindicación 6, en el que la respuesta de célula T auxiliar es una respuesta restringida a HLA-

DR1. 5

8. Método según la reivindicación 6, en el que la respuesta de célula T citotóxica es una respuesta restringida a HLA-A2.

9. Método según la reivindicación 6, en el que la respuesta de célula T auxiliar es una respuesta restringida a HLA10 DR1, y en el que la respuesta de célula T citotóxica es una respuesta restringida a HLA-A2.

10. Método para determinar simultáneamente la respuesta humoral, la respuesta de célula T auxiliar y la respuesta de célula T citotóxica de un ratón tras su inmunización con un antígeno o una vacuna que comprende uno o más antígenos, comprendiendo el método:

a) administrar el antígeno o la vacuna que comprende uno o más antígenos a un ratón de la reivindicación 1 o 2;

b) analizar una respuesta humoral específica en el ratón frente al antígeno o vacuna que comprende uno o más antígenos; 20 c) analizar una respuesta de célula T auxiliar en el ratón frente al antígeno o vacuna que comprende uno o más antígenos; y d) analizar una respuesta de célula T citotóxica en el ratón frente al antígeno o vacuna que comprende uno o más 25 antígenos.

11. Método según la reivindicación 10, en el que la respuesta de célula T auxiliar es una respuesta restringida a HLA-DR1, de TH.

12. Método según la reivindicación 10, en el que la respuesta de célula T citotóxica es una respuesta restringida a HLA-A2, de CTRL.

13. Método para optimizar dos o más composiciones de vacunas candidatas para la administración a un ser humano, basándose en criterios preseleccionados, comprendiendo el método: determinar simultáneamente la 35 respuesta humoral, la respuesta de célula T auxiliar, y la respuesta de célula T citotóxica de un ratón tras su inmunización con las dos o más composiciones de vacunas candidatas, usando un método que comprende administrar dichas composiciones de vacuna que comprenden uno o más antígenos al ratón transgénico de las reivindicaciones 1 o 2, analizar una respuesta humoral específica en dicho ratón frente a dichas composiciones de vacuna, analizar una respuesta de célula T auxiliar en dicho ratón frente a dichas composiciones de vacuna, analizar una respuesta de célula T citotóxica en dicho ratón frente a dichas composiciones de vacuna, y seleccionar una vacuna optimizada aplicando a los resultados criterios preseleccionados.

14. Método según la reivindicación 13, en el que las dos o más vacunas candidatas difieren sólo en la proporción entre el antígeno y el adyuvante presente en la vacuna. 45

15. Método según la reivindicación 13, en el que las dos o más vacunas candidatas difieren sólo en el tipo de adyuvante presente en la vacuna.

16. Método para determinar si una vacuna presenta un riesgo de inducción de una enfermedad autoinmunitaria 50 cuando se administra a un ser humano, comprendiendo el método:

a) administrar la vacuna a un ratón de la reivindicación 1 o 2; y b) analizar una respuesta autoinmunitaria en el ratón; en el que 55 la observación de una respuesta autoinmunitaria en el ratón indica que la vacuna presenta un riesgo de inducción de una enfermedad autoinmunitaria cuando se administra a un ser humano.

17. Célula de ratón transgénico aislada que tiene genes endógenos no funcionales de H2 clase I y H2 clase II, y que comprende un transgén funcional de HLA-A2 y un transgén funcional de HLA-DR1, en la que dicho transgén de 60 HLA-A2 es una monocadena que comprende la beta 2 microglobulina humana enlazada covalentemente a la cadena pesada de HLA-A2.

18. Célula de ratón transgénico según la reivindicación 17, en la que el transgén de HLA-A2 comprende la secuencia de HLA-A2 proporcionada en el listado de secuencias en SEC ID nº 1, y el transgén de HLA-DR1 comprende la 65 secuencia de HLA-DR1 proporcionada en el listado de secuencias en SEC ID nº 2 y SEC ID nº 3.