Proteína de fusión antiinflamatoria.

Proteína de fusión que presenta:

(a) un primer polipéptido que se une específicamente a LDL oxidada (oxLDL),

y

(b) un segundo polipéptido que media una dimerización, caracterizada porque el primer polipéptido presenta un segmento o una variante de secuencia de CD68, que presentan respectivamente la función de unión a LDL de CD68.

Proteína de fusión antiinflamatoria La presente invención se refiere a una proteína de fusión con potencial terapéutico y diagnóstico contra enfermedades vasculares crónicas, tales como aterosclerosis, a una molécula de ácido nucleico que codifica para esta proteína de fusión, a una composición farmacéutica y de diagnóstico que presenta la proteína de fusión o molécula de ácido nucleico, a un uso de la proteína de fusión o de la molécula de ácido nucleico para la producción de una composición farmacéutica o de diagnóstico, a un procedimiento para el diagnóstico de enfermedades vasculares agudas o crónicas, así como a un procedimiento para la producción de la proteína de fusión.

La aterosclerosis es un proceso patológico activo, altamente complejo en cuyo centro se encuentra una reacción inflamatoria en las paredes de los vasos sanguíneos de un individuo afectado. El origen de la aterosclerosis, la denominada aterogénesis, puede dividirse en varias fases.

La fase temprana de la aterogénesis se caracteriza por una denominada disfunción endotelial. Una serie de diferentes factores de riesgo, tales como por ejemplo fumar, sobrepeso, inactividad física, hiperlipoproteinemia y diabetes de tipo II así como otros factores no identificados hasta el momento, llevan a un deterioro del endotelio. Por ello aumenta la permeabilidad del endotelio para lipoproteínas y otras sustancias en circulación en el plasma. Como resultado se activan las células endoteliales y expresan más las denominadas moléculas de adhesión sobre la superficie celular. Entre ellas, sobre todo las denominadas selectinas median en primer lugar el contacto temporal de determinadas células sanguíneas tales como monocitos y linfocitos T con el endotelio. Mediante un grupo adicional de moléculas de adhesión, las denominadas Cellular Adhesion Molecules (CAM) (moléculas de adhesión celular) , se produce la adherencia firme de estas células a la pared vascular. Especialmente en las ramificaciones vasculares, los sitios en los que se originan frecuentemente lesiones ateroscleróticas, participan además fuerzas mecánicas. Fuerzas de cizallamiento elevadas pueden reducir la formación de nitrógeno endotelial (NO) . El NO actúa dilatando los vasos y tiene propiedades antiinflamatorias. Además, fuerzas de cizallamiento elevadas llevan a un aumento de formación de moléculas de adhesión con las consecuencias descritas anteriormente.

A continuación, sobre todo los monocitos y en menor medida los linfocitos T, penetran en el espacio subintimal. Esta penetración se media por otro grupo de moléculas, a las que pertenecen por ejemplo la quimiocina proteína quimioatractante de monocitos 1 (MCP-1) . Se produce la diferenciación de los monocitos en macrófagos en el espacio subintimal.

En el endotelio deteriorado se produce además la oxidación de lipoproteína de baja densidad (LDL) y de este modo la formación de oxLDL. La oxLDL se emite al espacio subintimal, en el que carga los macrófagos que se desprenden a partir de monocitos en el mismo. Estos macrófagos se transforman mediante la carga con oxLDL en las denominadas células espumosas, las células características de las placas ateroscleróticas que, como componentes adicionales contienen, entre otros, linfocitos T y células del músculo liso que inmigran desde los medios.

Una placa aterosclerótica de este tipo se deposita en las paredes arteriales y se recubre a este respecto por una tapa fibrosa estabilizadora compuesta por células del músculo liso y matriz extracelular. La placa aterosclerótica se encuentra ahora en el centro de una reacción inflamatoria, en la que se produce la producción de los más diversos mediadores inflamatorios, tales como citocinas, quimiocinas, proteasas etc. A este respecto puede producirse necrosis tisular, depositándose en sus proximidades sales de calcio. De esta manera puede estrecharse la luz del vaso hasta el cierre completo con el resultado de trastornos circulatorios.

Si se produce una reducción de la formación de matriz extracelular por las células del músculo liso y su aumento de degradación por enzimas degradantes, se produce el adelgazamiento de la tapa fibrosa y se desestabiliza la placa aterosclerótica. La placa puede desgarrarse, dejando al descubierto el núcleo lipídico trombogénico y el colágeno en el vaso sanguíneo. La activación debida a esto del sistema de hemostasia lleva a la formación de trombos oclusivos y no oclusivos, es decir a la activación de la cascada de coagulación, en cuyo centro se encuentra el denominado Tissue Factor (TF) (factor tisular) . Desde el punto de vista clínico, la ruptura de placa se manifiesta con la formación de trombos como angina de pecho inestable o infarto de miocardio agudo.

Actualmente la aterosclerosis se trata por regla general mediante la administración de agentes reductores de lípidos o estatinas. A este respecto se trata de un grupo de principios activos que inhiben finalmente la síntesis de colesterol endógeno. Entre las estatinas figuran, entre otras, atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina (mevinolina) , mevastatina (compactina) , pravastatina y simvastatina. Estas sustancias influyen de distinta manera en el metabolismo lipídico, por ejemplo mediante la inhibición competitiva de la enzima clave de la síntesis de colesterol, la 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima-A-reductasa, mediante la disminución de la síntesis de colesterol en el hígado, mediante el aumento de los receptores de LDL en las células del hígado y mediante la modificación de la composición de lipoproteína. Las estatinas tienen una gran influencia sobre la composición de los lípidos en el suero y llevan, entre otras cosas, a un ligero incremento de la concentración de las denominadas "High Density Lipoproteins" (HDL) (lipoproteínas de alta densidad) y a una gran reducción de la concentración de LDL. En conjunto, mediante la acción de las estatinas, circulan menos grasas en la sangre, de modo que las placas ateroscleróticas acumulan menos grasa y de este modo se reduce el riesgo de una trombosis y de los peligros que resultan de la misma.

Aunque se atribuye a las estatinas aún una serie de propiedades positivas adicionales, éstas han sido objeto críticas debido a una acumulación sorprendente de efectos secundarios raros pero graves en los músculos y riñones en relación con la toma. Por este motivo se retiró del mercado especialmente el principio activo cerivastatina (por ejemplo Lipobay®, Zenas®) en Alemania en agosto de 2001.

El documento EP 1 046 652 describe una proteína de fusión que presenta un dominio extracelular de receptor LOX1 bovino y un dominio Fc y que se usa en un ensayo para examinar la interacción de LDL oxidada y del receptor LOX-1.

En este contexto, es objetivo de la presente invención proporcionar una nueva sustancia que presente el potencial terapéutico y de diagnóstico en cuanto al tratamiento y el diagnóstico de enfermedades vasculares agudas o crónicas, tales como la aterosclerosis o placas arterioscleróticas, y con la que se eviten en su mayor parte o se reduzcan las desventajas mencionadas anteriormente de los agentes reductores de lípidos conocidos.

Este objetivo se alcanza mediante una proteína de fusión que presenta (a) un primer polipéptido que se une específicamente a LDL oxidada (oxLDL) así como (b) un segundo polipéptido que media una dimerización, presentando el primer polipéptido un segmento o una variante de secuencia de CD68, que presenta la función de unión a LDL de CD68.

Según la invención, por una proteína de fusión se entiende una proteína híbrida o una proteína artificial que puede producirse in vitro pero también in vivo mediante procedimientos de Biología Molecular conocidos en el estado de la técnica. Para ello se usan preferentemente vectores de expresión habituales que codifican para la proteína de fusión según la invención. Estos vectores de expresión se introducen en una célula adecuada que produce después la proteína de fusión.

El primer polipéptido está configurado a este respecto mediante la elección adecuada de la secuencia de aminoácidos de tal manera que éste adopte una estructura secundaria o terciaria, que se une de manera selectiva y con alta afinidad a lipoproteína de baja densidad oxidada (oxLDL) . Esto es fácil para un químico especializado en síntesis de proteínas, dado que en el estado de la técnica se conoce la estructura espacial de LDL. El segundo polipéptido se configura en cuanto a su secuencia de aminoácidos de tal manera que éste presente un... [Seguir leyendo]

1. Proteína de fusión que presenta:

(a) un primer polipéptido que se une específicamente a LDL oxidada (oxLDL) , y

(b) un segundo polipéptido que media una dimerización,

caracterizada porque el primer polipéptido presenta un segmento o una variante de secuencia de CD68, que presentan respectivamente la función de unión a LDL de CD68.

2. Proteína de fusión según la reivindicación 1, caracterizada porque el primer polipéptido presenta CD68, preferentemente presenta el dominio extracelular de CD68 o un fragmento o una variante del mismo que presentan respectivamente la función de unión a LDL de CD68.

3. Proteína de fusión según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque el segundo polipéptido presenta un dominio Fc de una inmunoglobulina o un fragmento o una variante del mismo que presentan respectivamente la función de dimerización del dominio Fc.

4. Proteína de fusión según la reivindicación 3, caracterizada porque la variante del dominio Fc presenta una mutación en la región de unión al complemento y al receptor de Fc tal que reduce la inmunogenicidad de la proteína de fusión.

5. Proteína de fusión según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la proteína de fusión presenta además un elemento que conecta el primer polipéptido con el segundo polipéptido.

6. Proteína de fusión según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el primer polipéptido presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 1 del protocolo de secuencias adjunto.

7. Proteína de fusión según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el primer polipéptido es codificado por una molécula de ácido nucleico, que presenta la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 2 ó 3 del protocolo de secuencias adjunto, o variantes de la misma, que debido a la degeneración del código genético codifican para el mismo polipéptido.

8. Proteína de fusión según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el segundo polipéptido presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 4 del protocolo de secuencias adjunto.

9. Proteína de fusión según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque el segundo polipéptido es codificado por una molécula de ácido nucleico que presenta la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 5 del protocolo de secuencias adjunto, o una variante de la misma, que debido a la degeneración del código genético codifica para el mismo polipéptido.

10. Proteína de fusión según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 6 del protocolo de secuencias adjunto.

11. Proteína de fusión según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque es codificada por una molécula de ácido nucleico que presenta la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 7 u 8 del protocolo de secuencias adjunto, o variantes de la misma, que debido a la degeneración del código genético codifican para la misma proteína de fusión.

12. Proteína de fusión según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque la proteína de fusión presenta además un marcador detectable.

13. Homodímero que presenta la proteína de fusión según una de las reivindicaciones 1 a 12.

14. Molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína de fusión según una de las reivindicaciones 1 a 12.

15. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 14, que presenta:

(a) una primera secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que se une específicamente a oxLDL, y

(b) una segunda secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que media una dimerización,

caracterizada porque el primer polipéptido presenta la función de unión a LDL de CD68.

16. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 14 ó 15, caracterizada porque presenta la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 2 ó 3, del protocolo de secuencias adjunto, o variantes de la misma, que debido a la degeneración del código genético codifican para el mismo polipéptido.

17. Molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizada porque presenta la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 5 del protocolo de secuencias adjunto, o una variante de la misma, que debido

a la degeneración del código genético codifica para el mismo polipéptido.

18. Molécula de ácido nucleico, según una de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizada porque presenta la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 7 u 8 del protocolo de secuencias adjunto, o variantes de la misma, que debido a la degeneración del código genético codifican para el mismo polipéptido.

19. Composición farmacéutica y/o de diagnóstico que presenta la proteína de fusión según una de las reivindicaciones 1 a 12 y/o el homodímero según la reivindicación 13 y/o la molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 14 a 18 y dado el caso un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico y/o de diagnóstico así como dado el caso aditivos activos desde el punto de vista farmacéutico y/o de diagnóstico adicionales.

20. Uso de la proteína de fusión según una de las reivindicaciones 1 a 12 y/o del homodímero según la reivindicación 13 y/o de la molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 14 a 18 para la producción de una composición farmacéutica y/o de diagnóstico para el tratamiento y/o el diagnóstico de enfermedades vasculares agudas o crónicas, incluyendo aterosclerosis y placas ateroscleróticas.

21. Procedimiento para la producción de la proteína de fusión según una de las reivindicaciones 1 a 12, que presenta las siguientes etapas:

(1) proporcionar una primera secuencia de nucleótidos que codifique para un polipéptido que se une específicamente a oxLDL, que presenta la función de unión a LDL de CD68,

(2) proporcionar una segunda secuencia de nucleótidos que codifique para un polipéptido que media una dimerización,

(3) ligar la primera y la segunda secuencia de nucleótidos para obtener una secuencia de fusión que codifique para la proteína de fusión,

(4) clonar la secuencia de fusión en un vector de expresión,

(5) introducir el vector de expresión en una célula adecuada para la expresión,

(6) expresar la proteína de fusión en la célula, y

(7) aislar la proteína de fusión a partir de la célula.

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