Proteína de fusión al antígeno carcinoembrionario y sus usos.

Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusiónde CEA,

en la que la proteína de fusión de CEA comprende una proteína CEA humana truncada en el extremo Cque carece de los aminoácidos 679 - 702 de la SEC ID Nº: 20, fusionada a un elemento inmunopotenciador que esla subunidad B de la enterotoxina termolábil de E. coli (LTB) que opcionalmente tiene truncada la secuencia señal; yen la que la proteína de fusión es capaz de producir una respuesta inmunitaria en un mamífero.

Proteína de fusión al antígeno carcinoembrionario y sus usos

Campo de la invención

La presente invención se refiere, en líneas generales, a la terapia del cáncer. Más específicamente, la presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican proteínas de fusión en las que las proteínas de fusión comprenden al menos una parte del polipéptido conocido como antígeno carcinoembrionario asociado a tumores. La presente invención también proporciona vectores recombinantes y hospedadores que comprenden dichos polinucleótidos, proteínas de fusión purificadas y procedimientos para mejorar una respuesta inmunitaria contra CEA usando las composiciones y moléculas desveladas en el presente documento.

Antecedentes de la invención

La superfamilia de inmunoglobulinas (SFIg) consiste en numerosos genes que codifican proteínas con diversas funciones, una de las cuales es la adhesión intercelular. Las proteínas de la SFIg contienen al menos un dominio relacionado con Ig que es importante para mantener las interacciones de unión intermolecular adecuadas. Como estas interacciones son necesarias para las diversas funciones biológicas de los miembros de la SFIg, la alteración o expresión aberrante de muchas moléculas de adhesión de SFIg se han correlacionado con muchas enfermedades humanas.

El antígeno carcinoembrionario (CEA) pertenece a una subfamilia de la superfamilia de Ig que consiste en glicoproteínas de superficie celular conocidas como moléculas de adhesión a células relacionadas con el CEA (CEACAM) . Se ha demostrado que las CEACAM actúan como moléculas de adhesión intercelular homotípicas y heterotípicas (Benchimol y col., Cell 57: 327-334 (1989) ) . Además de la adhesión celular, el CEA (conocido también como CEACAM5) inhibe la muerte celular resultante de la separación de las células de la matriz extracelular y puede contribuir a la transformación celular asociada con determinados proto-oncogenes tales como Bcl2 y c-Myc (véase, Berinstein, J. Clin Oncol. 20 (8) : 2197-2207 (2002) ) . Se han clonado y caracterizado secuencias que codifican CEA humano (Patente de Estados Unidos Nº 5.274.087; 5.571.710; y Nº 5.843.761. Véase también Beauchemin y col., Mol. Cell. Biol. 7: 3221-3230 (1987) ; Zimmerman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 84: 920-924 (1987) ; Thompson y col. Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 84 (9) : 2965-69 (1987) ) .

Se ha detectado una expresión normal de CEA durante el desarrollo fetal y en la mucosa colónica adulta. La sobreexpresión de CEA se detectó en primer lugar en tumores de colon humano hace 30 años (Gold y Freedman, J. Exp. Med. 121: 439-462 (1965) ) y se ha encontrado desde entonces prácticamente en todos los tumores colorrectales. Adicionalmente, la sobreexpresión de CEA puede detectarse en un alto porcentaje de adenocarcinomas del páncreas, hígado, mama, ovario, cuello uterino y pulmón. Debido a su frecuencia en estos tipos de tumor y a la expresión tisular normal limitada, se considera que el CEA es un autoantígeno asociado a tumores y una diana para la inmunoterapia activa y pasiva. Recientes datos clínicos han establecido que diferentes estrategias con vacunas pueden generar linfocitos B y T humanos específicos para el CEA, proporcionando pruebas adicionales de que CEA es una diana para la intervención molecular e inmunológica para el tratamiento de estos tipos de cánceres.

Las estrategias terapéuticas que se dirigen a CEA incluyen el uso de anticuerpos anti-CEA (véase Chester y col., Cancer Chemother. Pharmacol. 46 (Suppl) : S8-S12 (2000) ) , así como vacunas basadas en CEA (para una revisión, véase Berinstein, anteriormente) . El desarrollo y comercialización de muchas vacunas se ha obstaculizado por dificultades asociadas con la obtención de altos niveles de expresión de genes exógenos. El éxito de las vacunas basadas en ADN también se ha obstaculizado por la incapacidad de generar una respuesta inmunitaria de suficiente magnitud en los individuos tratados. Aunque se han desarrollado vacunas de ADN que se dirigen a diversas proteínas, las respuestas inmunitarias resultantes han sido relativamente débiles en comparación con las vacunas convencionales.

La facilidad de manipulación del ADN ha ofrecido una oportunidad para desarrollar vacunas que incorporan estrategias de fusión de genes en las que los antígenos están unidos a diversos elementos inmunopotenciadores. La potenciación de la respuesta inmunitaria contra antígenos diana se ha demostrado en modelos animales por vectores que codifican antígenos fusionados a la proteína de choque térmico (HSP) 70 (Liu y col., J. Virol. 74: 288894 (2000) ; Cheng y col. J. Immunol. 166: 6218-26 (2001) ; Chen y col., Cancer Res. 60: 1035-42 (2000) ) , a la parte Fc de IgG1 (You y col., J. Immunol. 165: 4581-92 (2000) ) , a la proteína de membrana asociada a lisosomas (LAMP) (Su y col., Cancer Res. 62: 5041-48 (2002) ) , y al epítopo Th universal de la toxina tetánica (Renard y col., J. Immunol. 171:1588-95 (2003) ; King y col., Nature Med. 4: 1281-86 (1998) ; Lund y col., Cancer Gene Ther. 10: 36576 (2003) ; Padua y col., Nature Med. 9 (11) : 1413-17 (2003) ; Savelyeva y col., Nature Biotechnol. 19: 760-64 (2001) ; Wahren y col., documento WO 2004/092216) . La potenciación de las respuestas inmunitarias contra antígenos diana es particularmente relevante para las vacunas contra el cáncer en vista de la inmunogenicidad limitada de antígenos tumorales y de la necesidad de superar la tolerancia para ejercer efectos antitumorales eficaces.

Por lo tanto, a pesar de la identificación de las secuencias de nucleótidos de tipo silvestre que codifican proteínas CEA descritas anteriormente, sería muy deseable desarrollar una vacuna que fuera capaz de provocar una

respuesta inmunitaria específica de CEA potenciada con respecto a un ADNc de CEA de longitud completa de tipo silvestre, cuando se administra a un mamífero. También sería deseable desarrollar procedimientos para tratar o prevenir cánceres asociados con CEA que utilicen moléculas de ácido nucleico o proteínas que potencien de manera segura y eficaz una respuesta inmunitaria específica de CEA.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican proteínas de fusión en las que las proteínas de fusión comprenden al menos una parte del polipéptido conocido como antígeno carcinoembrionario asociado a tumores, fusionado a una parte sustancial de un elemento inmunopotenciador. La parte de CEA de la proteína de fusión de CEA codificada se deleciona de su dominio de anclaje C-terminal, es decir aminoácidos 679-702 de la SEC ID Nº: 20, y el elemento inmunopotenciador es la subunidad B de la enterotoxina termolábil de E. coli, opcionalmente truncada de su secuencia señal. La presente invención también proporciona vectores recombinantes incluyendo, pero sin limitación, vectores de adenovirus y plásmidos, que comprenden dichos polinucleótidos y células huésped que comprenden dichos vectores recombinantes. También se proporciona en el presente documento proteínas de fusión purificadas codificadas por los polinucleótidos de la invención.

La presente invención proporciona adicionalmente composiciones para su uso en procedimientos para inhibir o prevenir el desarrollo de un cáncer en un mamífero provocando una respuesta inmunitaria contra la proteína CEA mediante la administración de una vacuna o una composición farmacéutica que comprende las fusiones de CEA o proteínas de fusión de CEA descritas en el presente documento. En realizaciones preferidas de los procedimientos del presente documento, la respuesta inmunitaria está potenciada con respecto a la respuesta provocada por una vacuna de CEA de tipo silvestre.

Como se usa a lo largo de la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “uno”, “una”, “el” y “la” incluye la referencia plural salvo que el contexto claramente dicte otra cosa.

Como se usa a lo largo de la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, se aplican las siguientes definiciones y abreviaturas:

El término “promotor” se refiere a un sitio de reconocimiento en una cadena de ADN al cual se une la ARN polimerasa. El promotor forma un complejo de iniciación con la ARN polimerasa para iniciar y dirigir la actividad transcripcional. El complejo puede modificarse activando secuencias denominadas “potenciadoras” o inhibiendo secuencias denominadas... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión de CEA, en la que la proteína de fusión de CEA comprende una proteína CEA humana truncada en el extremo C que carece de los aminoácidos 679 - 702 de la SEC ID Nº: 20, fusionada a un elemento inmunopotenciador que es la subunidad B de la enterotoxina termolábil de E. coli (LTB) que opcionalmente tiene truncada la secuencia señal; y en la que la proteína de fusión es capaz de producir una respuesta inmunitaria en un mamífero.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la subunidad B de LT tiene truncada su secuencia señal.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2, en la que la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 11 o SEC ID Nº: 12.

4. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3, en la que la secuencia de nucleótidos es como se expone en la SEC ID Nº: 12.

5. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2, en la que el extremo C-terminal de la proteína CEA está fusionado al extremo N-terminal de la subunidad B de LT.

6. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

7. El vector de la reivindicación 6, en el que el vector es un vector de adenovirus o un vector plasmídico.

8. El vector de la reivindicación 7, en el que el vector es un vector Ad 5.

9. El vector de la reivindicación 7, en el que el vector es un vector Ad 6 y un vector Ad 24.

10. El vector de la reivindicación 7, en el que el vector es un vector Ad de chimpancé.

11. El vector de la reivindicación 7, en el que el vector es pV1JnsB.

12. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 7.

13. Un procedimiento para expresar una proteína de fusión de CEA en una célula huésped recombinante, que comprende:

(a) introducir un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 en una célula huésped adecuada; y

(b) cultivar la célula huésped en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína de fusión de CEA humana.

14. Una proteína de fusión de CEA purificada codificada por la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

15. La proteína de fusión de CEA purificada de la reivindicación 14, en la que la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste las SEC ID Nº: 10 y 13.

16. Un vector de vacuna de adenovirus que comprende un genoma adenoviral con una deleción en la región E1, y un inserto en la región E1, en el que el inserto comprende un casete de expresión que comprende:

(a) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión de CEA, en el que la proteína de fusión de CEA comprende una proteína CEA humana truncada en el extremo C que carece de los aminoácidos 679 -702 de la SEC ID Nº: 20, fusionada a un elemento inmunopotenciador que es la subunidad B de la enterotoxina termolábil de E. coli (LTB) con su secuencia señal opcionalmente truncada; y en el que la proteína de fusión es capaz de producir una respuesta inmunitaria en un mamífero;

(b) un promotor unido operativamente al polinucleótido.

17. Un vector de adenovirus de acuerdo con la reivindicación 16 que es un vector Ad 5, un vector Ad 6 o un vector Ad 24.

18. Un plásmido de vacuna que comprende una parte plasmídica y una parte de casete de expresión, comprendiendo la parte de casete de expresión:

(a) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión de CEA, en el que la proteína de fusión de CEA comprende una proteína CEA humana truncada en el extremo C que carece de los aminoácidos 679 - 702 de la SEC ID Nº: 20, fusionada a un elemento inmunopotenciador que es la subunidad B de la enterotoxina termolábil de E. coli (LTB) con su secuencia señal opcionalmente truncada; y en el que la proteína de fusión es capaz de producir una respuesta inmunitaria en un mamífero; y,

(b) un promotor unido operativamente al polinucleótido.

19. Un vector de vacuna que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 para su uso en la prevención o el tratamiento de cáncer en un mamífero.

20. Un vector de vacuna de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el vector está de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16-18.

Secuencia de nucleótidos de hCEA-LTA

Secuencia de aminoácidos de CEA-LTA Secuencia codificante de hCEA-LTB

Secuencia de aminoácidos de CEA-LTB Secuencia de nucleótidos de CEAopt-LTB

Secuencia codificante de hCEA-LTBopt

Secuencia de aminoácidos de hCEA-LTB

Secuencia de aminoácidos de RhCEAopt-LTBopt Secuencia de nucleótidos del primer CEA de mono rhesus

Secuencia de nucleótidos del segundo CEA de mono rhesus

Secuencia de aminoácidos de la primera proteína CEA de mono rhesus

Secuencia de aminoácidos de la segunda proteína CEA de mono rhesus Secuencia de aminoácidos de la proteína CEA humana