Polipéptido aislado con actividad de proteasa, seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad para aminoácidos 1- 192 de la SEC ID nº: 2 de al menos un 80%;

(b) un fragmento de (a) que tiene actividad de proteasa.

Proteasas de Nocardiopsis Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a polipéptidos aislados con actividad de proteasa y secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican los polipéptidos. La invención también se refiere a construcciones de ácidos nucleicos, vectores y células huésped, incluyendo células de plantas y animales, comprendiendo las secuencias de ácidos nucleicos, al igual que métodos para producción y uso de los polipéptidos, en particular, el uso de los polipéptidos en alimento para animales y detergentes.

Antecedentes de la invención

Proteasas derivadas de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 y Nocardiopsis dassonvillei NRRL 18133 se describen en la WO 88/03947. El ADN y secuencias de aminoácidos de la proteasa derivados de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 se muestran en DK aplicación nº 1996 00013. La WO 01/58276 divulga el uso en alimento para animales de proteasas de ácido estables relacionadas con la proteasa derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262, al igual que una proteasa derivada de Nocardiopsis alba DSM 14010.

La JP 2-255081-A divulga una proteasa derivada de Nocardiopsis sp. cepa OPC-210 (FERM P-10508) , sin embargo, sin información de secuencia. La cepa ya no está disponible, ya que el depósito se retiró.

La DD 200432|8 divulga una preparación proteolítica derivada de Nocardiopsis dassonvillei cepa ZIMET 43647, sin embargo, sin información de secuencia. La cepa parece no estar ya disponible.

La JP 2003284571-A divulga la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADN correspondiente de una proteasa derivada de Nocardiopsis sp. TOA-1 (FERM P-18676) . La secuencia se ha introducido en GENESEQP con nº ADF43564.

Es un objeto de la presente invención proporcionar proteasas alternativas, en particular, para uso en alimento para animales y/o detergentes.

Resumen de la invención

Varias proteasas se clonaron, purificaron y caracterizaron. Estas proteasas se designan de la siguiente manera: proteasa L1a derivadas de Nocardiopsis dassonvillei subesp. dassonvillei DSM 43235 (ver SEC ID nº 1 y 2) ; proteasa L1b derivada de Nocardiopsis prasina DSM 15649 (ver SEC ID nº : 3 y 4) ; proteasa L1c derivada de Nocardiopsis prasina (previamente alba) DSM 14010 (ver SEC ID nº : 5 y 6) ; proteasa L2a derivada de Nocardiopsis sp. DSM 16424 (ver SEC ID nº : 7 y 8) ; proteasa L2b derivada de Nocardiopsis alkaliphila DSM 44657 (ver SEC ID nº : 9 y 10) ; y proteasa L2c derivada de Nocardiopsis lucentensis DSM 44048 (ver SEC ID nº : 11 y 12) .

Un polipéptido aislado con actividad de proteasa, seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad para aminoácidos 1-192 de la SEC ID nº : 2 de al menos 80%; (b) un fragmento de (a) que tiene actividad de proteasa.

La invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican los polipéptidos anteriores y a construcciones de ácidos nucleicos, vectores y células huésped comprendiendo las secuencias de ácidos nucleicos al igual que métodos para producción y uso de los polipéptidos, en particular, en alimento para animales y detergentes.

Descripción detallada de la invención Polipéptidos con actividad de proteasa [0010] Polipéptidos con actividad de proteasa, o proteasas, se designan también a veces también peptidasas, proteinasas, hidrolasas peptídicas o enzimas proteolíticas. Las proteasas pueden ser del tipo exo que hidrolizan péptidos empezando en cualquier extremo de estos, o del tipo endo que actúan internamente en las cadenas polipeptídicas (endopeptidasas) . Endopeptidasas muestran actividad en sustratos de péptido bloqueados N-y Cterminalmente que son pertinentes para la especificidad de la proteasa en cuestión.

El término "proteasa" se define aquí como una enzima que hidroliza enlaces peptídicos. Incluye cualquier enzima que pertenece al grupo enzimático EC 3.4 (incluyendo cada una de las trece subclases de esta) . El número EC se refiere a Enzyme Nomenclature 1992 de NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, California, incluyendo suplementos 1-5 publicados en Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6; y Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650 respectivamente. La nomenclatura es regularmente complementada y actualizada; ver, por ejemplo, la World Wide Web (WWW) en http: //www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.

Las proteasas se clasifican basándose en sus mecanismos catalíticos en los siguientes grupos: serina proteasas (S) , cisteína proteasas (C) , proteasas aspárticas (A) , metalo proteasas (M) , y desconocido, o aún sin clasificar, proteasas (U) , ver Handbook of Proteolytic Enzymes, A.J.Barrett, N.D.Rawlings, J.F.Woessner (eds) , Academic Press (1998) , en particular la parte de introducción general.

En formas de realización particulares, las proteasas de la invención y para uso según la invención son seleccionadas del grupo que consisten en:

(a) proteasas del grupo enzimático EC 3.4. . ;

(b) serina proteasas del grupo S del manual anterior;

(c) serina proteasas de la familia de peptidasa S2A; y/o

(d) serina proteasas de la familia de peptidasa S1 E como se describe en Biochem.J. 290:205-218 (1993) y en MEROPS protease database, release 6.20, March 24, 2003, (www.merops.ac.uk) . La base de datos se describe en Rawlings, N.D., O'Brien, E. A. & Barrett, A.J. (2002) MEROPS: the protease database.Nucleic Acids Res. 30, 343-346.

Para determinar si una proteasa dada es una serina proteasa, y una familia de proteasa S2A, se hace referencia al manual anterior y a los principios indicados en este. Tal determinación puede llevarse a cabo para todo tipo de proteasas, sean proteasas de origen natural o de tipo salvaje; o creadas genéticamente o proteasas sintéticas.

Actividad de proteasa puede medirse usando cualquier ensayo, en el que un sustrato se emplea, que incluye enlaces peptídicos pertinentes para la especificidad de la proteasa en cuestión. PH de ensayo y temperatura de ensayo se adaptan asimismo a la proteasa en cuestión. Ejemplos de valores de pH de ensayo son pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12. Ejemplos de temperaturas de ensayo son 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, o 95º C.

Ejemplos de sustratos de proteasa son caseína, como caseína entrecruzada con azurina (caseína AZCL) . Tres ensayos de proteasa se describen en los ejemplos 4-5 aquí, cualquiera de los cuales se puede usar para determinar actividad de proteasa. Para los fines de esta invención, el ensayo denominado pNA es un ensayo preferido.

No hay limitaciones en el origen de la proteasa de la invención y/o para uso según la invención. Así, el término proteasa incluye no solo proteasas naturales o de tipo salvaje obtenidas de microorganismos de cualquier género, sino también cualquier mutaciones, variantes, fragmentos etc. de estas que muestran actividad de proteasa, al igual que proteasas sintéticas, como proteasas transpuestas y proteasas de consenso. Tales proteasas creadas genéticamente se pueden preparar como se conoce generalmente en la técnica, por ejemplo, por mutagénesis dirigida, por PCR (usando un fragmento de PCR con la mutación deseada como uno de los cebadores en las reacciones de la PCR) , o por mutagénesis aleatoria. La preparación de proteínas de consenso se describe en, por ejemplo, el documento EP 897985. Transposición de genes se describe generalmente en, por ejemplo, los documentos WO 95/22625 y WO 96/00343. Recombinación de genes de proteasa puede hacerse independientemente de la secuencia específica de los progenitores por transposición sintética como se describe en Ness, J.E. et al, en Nature Biotechnology, Vol. 20 (12) , pp. 1251-1255, 2002. Oligonucleótidos sintéticos degenerados en su secuencia de ADN para proporcionar la posibilidad de que todos los aminoácidos encontrados en el conjunto de proteasas progenitoras se diseñan y los genes se ensamblan según la referencia. La transposición puede llevarse a cabo para la secuencia de longitud completa o para solo parte de la secuencia y luego más tarde combinada con el resto del gen para dar una secuencia de longitud completa. Las proteasas de las SEC ID nº : 2, 4, 6, 8, 10, y 12, al igual que las proteasas de Nocardiopsis descritas en los documentos previos catalogados anteriormente, son ejemplos particulares de tales proteasas progenitoras que se pueden someter a transposición como se ha descrito anteriormente, para proporcionar proteasas... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido aislado con actividad de proteasa, seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad para aminoácidos 1192 de la SEC ID nº : 2 de al menos un 80%;

(b) un fragmento de (a) que tiene actividad de proteasa.

2. Polipéptido según la reivindicación 1 que comprende aminoácidos 1-192 de la SEC ID nº : 2

3. Secuencia de ácidos nucleicos aislada comprendiendo una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido con actividad de proteasa, y que

(a) codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2;

(b) tiene un grado de identidad para nucleótido.

56. 1143 de la SEC ID nº : 1 de al menos un 80%.

4. Secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 3 que comprende nucleótido.

56. 1143 de la SEC ID nº : 1.

5. Construcción de ácidos nucleicos comprendiendo la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de las reivindicaciones 3-4 unida operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión adecuado.

6. Vector de expresión recombinante comprendiendo la construcción de ácidos nucleicos según la reivindicación 5.

7. Célula huésped recombinante comprendiendo el vector según la reivindicación 6.

8. Planta transgénica, o parte de planta, capaz de expresar el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

9. Animal transgénico no humano, o productos o elementos de este, siendo capaz de expresar el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

10. Método para la producción de un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, el método comprendiendo

(a) cultivo de una célula huésped recombinante según la reivindicación 7 para producir un sobrenadante comprendiendo el polipéptido; y

(b) recuperación del polipéptido.

11. Método para la producción de un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, el método comprendiendo

(a) cultivo de una cepa de Nocardiopsis dassonvillei subesp. dassonvillei DSM 43235 y

(b) recuperación del polipéptido.

12. Uso de al menos una proteasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-2

(i) en alimento para animales;

(ii) en aditivos de alimento;

(iii) en la preparación de una composición para uso en el alimento para animales;

(iv) para mejorar el valor nutritivo de un alimento para animales;

(v) para aumentar proteína soluble y/o digerible en el alimento para animales;

(vi) para aumentar el grado de hidrólisis de proteínas en dietas para animales; y/o

(vii) para el tratamiento de proteínas.

13. Método para mejorar el valor nutritivo de un alimento para animales, donde al menos una proteasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 se añade al alimento.

14. Aditivo de alimento comprendiendo

(a) al menos una proteasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y

(b) al menos una vitamina liposoluble, y/o

(c) al menos una vitamina hidrosoluble, y/o

(d) al menos un oligoelemento.

15. Aditivo de alimento según la reivindicación 14, que comprende además amilasa; fitasa; xilanasa; galactanasa; 5 alfa-galactosidasa; proteasa, fosfolipasa; y/o beta-glucanasa.

16. Alimento para animales con un contenido bruto de proteína de 50 a 800 g/kg y comprendiendo al menos una proteasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

17. Método para el tratamiento de proteínas, comprendiendo el paso de adición de al menos una proteasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 a al menos una proteína o fuente de proteína.

18. Método según la reivindicación 17, donde semilla de soja se incluye entre al menos una fuente de proteína.

19. Uso de al menos una proteasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en detergentes.