PROCESO PARA OBTENER LUTEÍNA A PARTIR DE ALGAS VERDES.

Un proceso para obtener luteína a partir de algas, caracterizado porque (a) se cultivan algas verdes seleccionadas de un grupo de cepas mutantes de Chlorella sorokiniana (SAG 211-32) identificadas por las referencias de depósito CCAP (i) CCAP 211-93,

(ii) CCAP 211-94, (iii) CCAP 211-95, y (iv) CCAP 211-96 para producir luteína hasta que se logra un contenido deseado del antioxidante, (b) las algas se cosechan y se utilizan como un producto y/o (c) el contenido de luteína se separa del resto de la biomasa

Proceso Para Obtener Luteína a Partir de Algas Verdes Campo de la invención La presente invención se relaciona con el área de la biotecnología y se refiere a un nuevo proceso para obtener 5 luteína de ciertos mutantes de las algas verdes y el uso de dichos mutantes para obtener luteína.

Antecedentes de la invención

Los carotenoides se sintetizan mediante todos los organismos fotosintéticos así como también mediante algunas bacterias u hongos no fotosintéticos. Existen dos clases principales de carotenoides que se presentan en la naturaleza: carotenos, que son hidrocarburos que son lineales o ciclizados en uno o ambos extremos de la molécula 10 y xantófilos, que son derivados oxigenados de carotenos. En las microalgas se puede hacer una distinción entre los carotenoides primarios y secundarios. Los carotenoides primarios, como luteína, funcionan como pigmentos accesorios en los fotosistemas, como componentes estructurales de complejos que recolectan luz en los cloroplastos, así como también agentes fotoprotectores y por lo tanto son esenciales para la supervivencia celular. Los carotenoides secundarios, como astaxantina, se acumulan en grandes cantidades en cuerpos de lípidos fuera de los cloroplastos, después de someter las células a condiciones de tensión. El papel de los carotenoides secundarios en células de algas no se entiende completamente. Estos pueden funcionar como filtros fotoprotectores y como antioxidantes que evitan la acumulación de los radicales de oxígeno.

La luteína se utiliza como tinte de alimentos y especialmente como aditivos de alimento en acuicultura y avicultura; también se utiliza para la coloración de fármacos y cosméticos. Durante los últimos años, se han encontrado 20 aplicaciones adicionales para luteína, especialmente en el campo de la salud humana. La luteína se utiliza como un nutracéutico contra degeneración macular. Se sabe que la luteína y zeaxatina cumplen una función crítica en mantener una función visual normal. Además del desarrollo de cataratas, también la progresión de aterosclerosis temprana parece estar impedida por la luteína. En los caninos y felinos, se ha probado que la luteína mejora la respuesta inmune tumoral y mediada por célula (Kim et al. 2000) . La luteína también puede servir para proteger la 25 piel del daño inducido por UV. El mercado global de luteína se ha incrementado marcadamente en los últimos años y se espera que alcance USD $ 187 millones en el 2009. Actualmente la fuente comercial de luteína es Marigold (Tagetes erecta y Tagetes patula) . Sin embargo, el contenido de luteína de flores Marigold es bajo (0.3 mg g 1 DW) , y por lo tanto hay un aumento interesante en las microalgas como fuente alternativa de este carotenoide. Por ejemplo, las micro-algas Muriellopsis sp., Chlorella zofingiensis, Scenedesmus almeriensis y Chlorella protothecoides ya se han propuesto como fuentes potenciales de luteína. No obstante, las productividades de luteína descritas no son suficientemente altas para ser económicamente factibles en una escala industrial.

La EP-A-1 808 483 describe un proceso para obtener luteína a partir de algas, utilizando Chlorella sorokiniana (SAG 211-32) .

Por lo tanto el problema de fondo de la presente invención ha sido satisfacer la necesidad de mejorar la acumulación 35 y productividad de luteína, al seleccionar una cepa adecuada, optimizando las condiciones de cultivo y obteniendo superproducción de mutantes de luteína.

Descripción detallada de la invención La presente invención se relaciona con un proceso para obtener luteína a partir de algas que se caracteriza por (a) las algas verdes seleccionadas de un grupo de cepas mutantes de Chlorella sorokiniana (SAG 211-32) 40 identificadas por las referencias de depósito CCAP

(i) CCAP 211-93

(ii) CCAP 211-94

(iii) CCAP 211-95

(iv) CCAP 211-96

(b) las algas se cosechan y se utilizan como un producto y/o

(c) el contenido de luteína se separa del resto de la biomasa.

45 se cultivan para producir luteína hasta que se logra un contenido deseado del antioxidante,

Con el fin de evitar cualquier ambigüedad se establece que las cepas mutantes (i) a (iv) se han depositado antes del día de la presente solicitud ante la Colección de Cultivo de Algas y Protozoarios (CCAP) bajo los números de acceso 5 dados, todos bajo los términos del Tratado de Budapest. Las cepas de algas se describen aquí completamente y están abiertas al público.

De forma sorprendente se ha observado que los mutantes de Chlorella sorokiniana exhiben una productividad de luteína aumentada comparado con la forma natural. En particular, los mutantes muestran un mayor contenido en luteína, que mantiene el mismo índice de crecimiento como en la cepa natural.

Mutagenia

En el caso de mutagenia artificial existen diversas opciones conocidas en la técnica. Se pueden inducir mutaciones sobre la base de mutágenos químicos o físicos así como también sobre la base de sustancias activas biológicas. Entre los mutágenos químicos, físicos y biológicos se conocen en la técnica diversos compuestos útiles de los cuales son particularmente útiles los siguientes.

Por ejemplo tales mutágenos o noxa son de interés particular los cuales se seleccionan del grupo que consiste de agentes de intercalación, agentes alquilatantes, agentes desaminantes, análogos base, radiación electromagnética que comprende radiación radioactiva, y rayos x, radiación ionizante, temperatura elevada o de luz ultravioleta, sustancias biológicas activas que comprenden transposones que incluyen las tecnologías conocidas conectadas que comprende tecnologías recombinantes de gen, mutagenia de transposón y similares. Sin embargo, las mutaciones con base en una mutación espontánea también se incluyen en este contexto. En particular, entre los agentes de intercalación son bien conocidos los derivados acridina o los derivados fenantridina tal como bromuro de etidio también conocidos como bromuro de 2, 7-diamino-10-etil-6-fenilfenantridio o bromuro de 3, 8-diamino-5-etil-6-fenilfenantridinio. Como los compuestos de agentes alquilatantes también son útiles tales como derivados nitrosoguanidina o etil metanosulfonato; etil etanosulfonato, ácido nitroso, o HNO2. Sin embargo, con respecto a los derivados de nitrosoguanidina el compuesto N-metil-N'-nitro-nitrosoguanidina es de interés particular con el fin de llevar a cabo la presente invención. Con relación a los análogos base se pueden utilizar el compuesto 5-bromo-uracilo, que también se conoce como 5-bromodesoxiuridina desoxinucleosida, o 2-aminopurina.

Entre los transposones existen una cantidad de métodos publicados en la literatura que describen la mutagenia de transposón. Por ejemplo, retrotransposones o transposones DNS, por ejemplo transposón de fago Mu, o transposón 30 marcado, son bien conocidos y están disponibles para la inducción de mutaciones. Adicionalmente, también se puede lograr mutagenia dirigida a sitio al utilizar tecnologías conocidas tales como mutagenia de inserción de ligador, generación de mutantes de eliminación o mutagenia dirigida a oligonucleótidos. En general, se incluyen todos los métodos biológicos conocidos con base en recombinación de gen dentro del contexto de los métodos anteriores. Debido a que la persona experta es consciente de la gran variedad de literatura adecuada no hay necesidad de citar otra literatura específica.

Los micro-organismos que se van a mutagenizar se pueden exponer al mutágeno o los agentes que inducen mutación o noxa de acuerdo con cualesquier métodos conocidos. Sin embargo, de acuerdo con la presente invención, se prefiere que la mutagenia artificial se realice con por lo menos un mutágeno químico, en particular con un compuesto alquilatante, más particular con un compuesto nitroso, especialmente con un derivado nitrosoguanidina. Entre los derivados nitrosoguanidina se prefiere el compuesto N-metil-N'-nitro-nitrosoguanidina. En general la mutagenia se puede llevar a cabo al exponer una cantidad adecuada de células de las algas fotoautotróficas que se van a mutagenizar a un mutágeno o agente que induce mutágeno dentro de un tiempo y condiciones apropiadas.

En particular, se puede realizar mutagenia al suspender las células que se van a mutagenizar en un regulador 45 esterilizado o en agua esterilizada en una cantidad entre 107 a 109 células, por ejemplo exhibe una densidad de aproximadamente 108 células, o al rociarlas sobre una placa agar y exponerlas al mutágeno. En el caso de un medio líquido en el que... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para obtener luteína a partir de algas, caracterizado porque (a) se cultivan algas verdes seleccionadas de un grupo de cepas mutantes de Chlorella sorokiniana (SA.

21. 32) identificadas por las referencias de depósito CCAP

(i) CCA.

21. 93, (ii) CCA.

21. 94, (iii) CCA.

21. 95, y (iv) CCA.

21. 96

para producir luteína hasta que se logra un contenido deseado del antioxidante, 10 (b) las algas se cosechan y se utilizan como un producto y/o (c) el contenido de luteína se separa del resto de la biomasa.

2. Proceso de acuerdo con la Reivindicación 1, caracterizado porque se utilizan cepas mutantes obtenidas de Chlorella sorokiniana después de tratamiento con N-metil-N'-nitro-nitrosoguanidina (NG) .

3. Proceso de acuerdo con las Reivindicaciones 1 y/o 2, caracterizado porque el cultivo de las algas se realiza a una 15 temperatura de 20 a 40 °C.

4. Proceso de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones precedentes 1 a 3, caracterizado porque el cultivo se realiza utilizando un medio de cultivo mixotrófico.

5. Proceso de acuerdo con la Reivindicación 4, caracterizado porque se utiliza un medio de cultivo, que comprende nitratos 10 a 60 mM y sales de ácido acético 20 a 60 mM.

6. Proceso de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones precedentes 1 a 5, caracterizado porque el cultivo se realiza bajo una irradiación de luz d.

50. 1, 000 µE m-2 s-1.

7. Proceso de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones precedentes 1 a 6, caracterizado porque el cultivo se realiza bajo tensión.

8. Proceso de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones precedentes 1 a 7 caracterizado porque el cultivo se 25 realiza en un fotobiorreactor.

9. Proceso de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones precedentes 1 a 8 caracterizado porque las células cultivadas en la etapa (b) se recolectan para formar una suspensión concentrada, se agregan opcionalmente antioxidantes y emulsificantes a dicha suspensión, y las células recolectadas se interrumpen opcionalmente y se secan para obtener una luteína o un producto enriquecido con luteína.

10. Uso de las algas verdes seleccionadas de un grupo de cepas mutantes de Chlorella sorokiniana (SA.

21. 32) identificadas por las referencias de depósito CCAP

(i) CCA.

21. 93,

(ii) CCA.

21. 94,

(iii) CCA.

21. 95, y (iv) CCA.

21. 96 para la producción de luteína o producto enriquecido con luteína.