Procedimientos para la conservación del esperma y sus aplicaciones.

Uso de un medio de dilución del esperma, compuesto por:

- un medio base que contiene los componentes adecuados para la dilución del esperma de una especie dada,

dicho medio base comprende una solución de sales minerales e hidratos de carbono y no contiene leche;

- entre 1 y 100 g/l de fosfocaseinato nativo;

- del 0,5 al 12,5% en peso de materia seca de yema de huevo o del 0,4 al 10% en peso de materia seca de plasma de yema de huevo; y

- del 1 al 10% de glicerol;

para mejorar la capacidad de fecundación de espermatozoides debilitados por el proceso de congelación o por la clasificación de espermatozoides por citometría de flujo.

Procedimientos para la conservación del esperma y sus aplicaciones La presente invención se refiere a la conservación del esperma, y más en particular a la preservación de la capacidad de fecundación de los espermatozoides debilitados por un proceso de congelación u otro tratamiento.

Con el desarrollo de la biotecnología reproductiva, las técnicas de inseminación artificial son una práctica habitual en numerosas especies animales, principalmente en cabras, ovejas, cerdos, bovinos y equinos. No obstante, los espermatozoides son células complejas altamente especializadas que pueden perder rápidamente su capacidad de fecundación. Por lo tanto, la conservación a largo plazo en estado refrigerado (temperaturas positivas) o en estado congelado del esperma mientras se mantiene su capacidad de fecundación supone un problema.

Además, con el fin de permitir una conservación óptima del esperma hasta su utilización para la inseminación artificial, normalmente se utiliza un medio en el que el esperma se diluye inmediatamente después de su obtención. La mezcla esperma/medio de dilución se divide en alícuotas que contienen un número de espermatozoides suficientes para fecundar el óvulo, por ejemplo un mínimo de 2 x 108 espermatozoides en caballos para la inseminación artificial de semen "fresco". Según el medio de dilución utilizado y la temperatura a la que se conserva la mezcla de esperma/medio, la vida útil en general varía entre algunas horas a varios días, o un periodo más prolongado en el caso de que el medio permita su congelación. El esperma conservado entre 4 º C y 20 º C presenta la desventaja de que debe ser utilizado en las horas o 2-3 días siguientes a su obtención. Por el contrario, la conservación del esperma por congelación permite conservar el semen de un macho durante varios años. Asimismo la congelación del esperma permite conservar el patrimonio genético de un macho de alto valor genético y que se pueda evaluar después de su muerte o su castración. La congelación del esperma permite además el trasporte del semen a criaderos geográficamente distantes del lugar de recogida, lo que facilita el intercambio y difusión del acervo genético o la venta internacional de semen.

No obstante, se ha demostrado que el proceso de congelación/descongelación disminuye el porcentaje de espermatozoides intactos (Watson. P.F., Anim. Reprod. Sci. 60-61: 481-492, 2000) : la congelación presenta el inconveniente de provocar la degradación de funciones fisiológicas importantes de los espermatozoides que reducen parcial o completamente su capacidad de fecundación. Dado que la calidad del semen es primordial en la inseminación artificial, una dosis de inseminación que contenga un número importante de espermatozoides muertos o debilitados presentará una capacidad de fecundación reducida, limitando así la fertilidad del macho después de la inseminación.

Por tanto, la puesta a punto de un medio de dilución que permita mejorar la conservación del semen y preservar una buena capacidad de fecundación de los espermatozoides después de su congelación es objeto de numerosas investigaciones.

En sementales, el medio que ha permitido las primeras fecundaciones después de inseminación artificial de semen congelado estaba constituido por leche entera pasteurizada que contenía un 10% de glicerol (Barker y col. Canadian Journal of Comparative Medical Veterinar y Science, 21:47-51, 1957) .

Entre los medios de dilución más frecuentemente utilizados para la congelación del semen de un semental, citaremos en particular los medios descritos por Martin y col. (J. Reprod. Fertil., Suppl. 27:47-51, 1979) , Burns P.J. (Proc. 12th International Congress on Animal Reproduction The Hague 1992; 4:1849-1851) , y el medio denominado "INRA82", descrito por Palmer E. (Proc. 10th International Congress on Animal Reproduction and Artificial Insemination, Urbana-Champaign, IL, USA, 3:377, 1984) , modificado por Magistrini y col. (Acta Veterinaria Scandinavica, 1st European Symposium on Production, Evaluation and Preservation of Stallion Semen, 1-2 de octubre de 1992, Uppsala, Suecia, Suppl. 88, 97-110) y que consiste en un medio base suplementado con leche desnatada UHT.

En general, estos medios de congelación se suplementan con diversas sustancias, con el fin de mejorar la protección de los espermatozoides. Vidament y col. (Theriogenology., 54, 907-19, 2000) han evolucionado la técnica descrita por Palmer E. (1984) : el esperma se diluye en el medio INRA82 suplementado con yema de huevo y se centrifuga, y los sedimentos de la centrifugación se recogen en el mismo medio suplementado adicionalmente con glicerol, antes de la congelación. Los mejores resultados se obtienen llevando a cabo la centrifugación y la adición de glicerol a una temperatura de 22º C, y a continuación una refrigeración gradual hasta 4 º C antes de la formación de pajillas y de la congelación; en estas condiciones, se observa, no sólo una mejora de la movilidad de los espermatozoides después de la descongelación, sino también una mejora de la fertilidad.

Sin embargo, incluso en estas condiciones optimizadas, la capacidad de fecundación de los espermatozoides después de la descongelación aún es inferior a la del semen fresco. Un estudio realizado en Francia en el periodo comprendido entre 1985-2005 en la Yeguada Nacional de Francia informa de que las tasas de gestación obtenidas después de inseminación artificial con el semen de sementales congelado en el medio INRA82 anteriormente mencionado suplementado con yema de huevo y glicerol en las condiciones indicadas anteriormente, y utilizando semen cuya movilidad después de la descongelación es superior al 35%, fue del 45-48% (Vidament. M., Anim. Reprod. Sci. 89:115-136, 2005) en comparación con el 55% para el semen fresco.

Además de los medios de dilución del esperma destinados a la congelación, también existen otros destinados a la conservación de los espermatozoides a temperaturas positivas. Así, la Solicitud PCT WO9837904 describe un medio de dilución del esperma constituido por un medio base que contiene, en lugar de leche, fosfocaseinato nativo, y/o ºlactoglobulina. A una temperatura de 4º C, el medio de dilución que contiene fosfocaseinato nativo presenta, in vitro, un rendimiento similar e incluso a veces inferior al del medio INRA82 constituido por un medio base suplementado con leche desnatada UHT; sin embargo, mejora de manera muy significativa la conservación del esperma a 15º C.

Los inventores han sometido a pruebas los efectos del medio de dilución del esperma, como se describe en la Solicitud PCT WO9837904, suplementado con yema de huevo y glicerol, sobre la conservación de los espermatozoides durante la congelación. Los primeros ensayos han demostrado que este medio no mejoraba los parámetros de movilidad de los espermatozoides después de la descongelación, en comparación con un medio base suplementado con leche (el INRA82 anteriormente mencionado) , y yema de huevo y glicerol. Sin embargo, los inventores ahora han encontrado que, sorprendentemente, mejoraba de manera significativa la capacidad de fecundación de los espermatozoides.

Esta mejora en la capacidad de fecundación parece estar relacionada con la capacidad de este medio para preservar eficazmente la integridad de la membrana de los espermatozoides por el estrés resultante de la congelación/descongelación. Por tanto, se puede utilizar para mejorar la capacidad de fecundación de espermatozoides debilitados, no sólo por el proceso de congelación, sino por cualquier otro tipo de manipulación que pueda tener un efecto perjudicial sobre las membranas de los espermatozoides. Estos incluyen principalmente citometría de flujo, utilizada en algunas especies de animales de granja, para separar los espermatozoides Y de los espermatozoides X antes de la inseminación.

La presente invención tiene por objeto la utilización de un medio de dilución del esperma, que comprende:

- un medio base que comprende los componentes adecuados para la dilución del esperma de una especie dada; -fosfocaseinato nativo; -yema de huevo o plasma de yema de huevo; y -glicerol;

para mejorar la capacidad de fecundación de espermatozoides debilitados o dañados por el proceso de congelación y/o por la clasificación de espermatozoides por citometría de flujo.

El medio base de la presente invención incluye una disolución de sales minerales e hidratos de carbono, y no incluye la leche. La yema de huevo está constituida por un fluido en el que se suspenden diversas partículas (ANTON,... [Seguir leyendo]

1. Uso de un medio de dilución del esperma, compuesto por:

- un medio base que contiene los componentes adecuados para la dilución del esperma de una especie dada, dicho medio base comprende una solución de sales minerales e hidratos de carbono y no contiene leche; -entre 1 y 100 g/l de fosfocaseinato nativo; -del 0, 5 al 12, 5% en peso de materia seca de yema de huevo o del 0, 4 al 10% en peso de materia seca de plasma de yema de huevo; y -del 1 al 10% de glicerol; para mejorar la capacidad de fecundación de espermatozoides debilitados por el proceso de congelación o por la clasificación de espermatozoides por citometría de flujo.

2. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de dilución del esperma comprende entre 10 y 50 g/l de fosfocaseinato nativo.

2. Uso según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el medio de dilución del esperma comprende del 0, 5 al 5% en peso de materia seca de yema de huevo o del 0, 4 al 4% en peso de materia seca de plasma de yema de huevo.

3. Uso según la reivindicación 3, caracterizado porque el medio de dilución del esperma comprende del 1 al 2, 5% de yema de huevo o del 0, 8 al 2% en peso de materia seca de plasma de yema de huevo, y del 2 al 5% de glicerol.

4. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el medio base contiene aditivos como antibióticos o antifúngicos.