Preparación de inmunoglobulina intravenosa de rendimiento ultra-alto.

Un procedimiento para el fraccionamiento de material basado en sangre para producir un producto deinmunoglobulina (IgG) intravenosa no desnaturalizada útil que comprende las etapas de:

(a) después de adquirir una cantidad predeterminada de material basado en sangre procesar y seleccionaruna cantidad de plasma como material basado en sangre;

(b) preparar dicha cantidad de plasma congelando el plasma, seguido de descongelación controladacalentando gradualmente el plasma a cero a cuatro grados centígrados para formar un plasmadescongelado en el que se suspende un crioprecipitado y separar el crioprecipitado para proporcionar unplasma crioempobrecido;

(c) efectuar una primera etapa de fraccionamiento en el plasma crioempobrecido añadiendo una primeracantidad predeterminada de citrato de sodio al plasma crioempobrecido para producir una primeraconcentración de citrato de sodio predeterminada de entre el once y el trece por ciento en peso endisolución para formar un primer producto de sobrenadante separable que tiene una concentración decitrato de sodio entre el once y el trece por ciento en peso en disolución y un primer producto de pastaresidual en el que el primer producto de sobrenadante separable está sustancialmente libre deeuglobulinas;

(d) separar el primer producto de sobrenadante separable del primer producto de pasta residual paracompletar la primera etapa de fraccionamiento;

(e) efectuar una segunda etapa de fraccionamiento en el primer producto de sobrenadante separableañadiendo una segunda cantidad predeterminada de citrato de sodio al primer producto de sobrenadanteseparable para producir una segunda concentración de citrato de sodio predeterminada de entre elveintiuno y el veintitrés por ciento en peso en disolución para formar un segundo producto de pastaseparable y un segundo producto de sobrenadante residual que tiene una concentración de citrato de sodioentre el veintiuno y el veintitrés por ciento en peso en disolución,

(f) separar dicho segundo producto de pasta separable de dicho segundo producto de sobrenadanteresidual para completar la segunda etapa de fraccionamiento;

(g) preparar dicho segundo producto de pasta separable para la diafiltración; y

(h) diafiltrar dicho segundo producto de pasta separable para formar un menor volumen del tercer productosustancialmente libre de citrato de sodio.

Peparación de inmunoglobulina intravenosa de rendimiento ultra-alto Preparación Campo de la invención La presente invención se refiere generalmente a procedimientos para la purificación de inmunoglobulinas del suero y más particularmente a procedimientos para la separación libre de alcohol de inmunoglobulina de plasma sanguíneo u otro material basado en sangre.

Antecedentes y descripción de la técnica relacionada Comúnmente, los procedimientos contemporáneos para la separación de inmunoglobulinas (IgG) de plasma sanguíneo u otro material basado en sangre dependen del trabajo anterior de Edwin J. Cohn como se ha encontrado en la patente de EE.UU. 5.177.194 concedida el 5 de enero de 1993 a Maria E. Sarno, y col. (SARNO) , “Un esquema en el uso generalizado es el procedimiento de fraccionamiento bien conocido de Cohn que se basa en la precipitación diferencial usando etanol frío”. Cohn y col. J. Am Chem. Soc. 68, 459 (1946) .

La patente de EE.UU. 2.390.074 concedida el 4 de diciembre de 1945 a Edwin J. Cohn (Cohn) desveló el uso de alcohol, acetona y dioxano como precipitantes en tales procedimientos de fraccionamiento. La dependencia continuada del alcohol como precipitante se ha demostrado adicionalmente en la patente de EE.UU. 6.893.639 B2 concedida el 17 de mayo de 2005 a Joshua Levy y col. (Levy) , en la que se establece “Los procedimientos industriales convencionales de purificación de inmunoglobulinas a partir de plasma sanguíneo se basan en el fraccionamiento con etanol frío que co-precipita grupos de proteínas basándose en sus puntos isoeléctricos a la concentración de alcohol dada a temperaturas bajo cero”.

El trabajo de Cohn se estimuló por la necesidad de las fuerzas armadas de una disolución estable para su uso como expansor del volumen del plasma durante la Segunda guerra mundial para sustituir el plasma liofilizado. Por consiguiente, el procedimiento de Cohn se basó en optimizar el procedimiento para separar la fracción de albúmina que proporciona la osmolalidad necesaria para la expansión del volumen del plasma.

Aún así, el uso de precipitantes de alcohol carece de dificultades, como se ilustra por Cohn, “Algunos precipitantes de proteínas tales como alcohol tienen una tendencia a desnaturalizar muchas proteínas con las que se ponen en contacto, aumentando el peligro de la desnaturalización con la concentración del alcohol y el aumento en la temperatura. Para muchas proteínas se ha encontrado aconsejable ejercer un cuidado considerable en la mezcla del precipitante con el plasma u otra disolución de proteínas con el fin de evitar la desnaturalización de la proteína”. Por este motivo se considera prudente proporcionar un procedimiento libre de alcohol para el fraccionamiento de plasma sanguíneo y otro material basado en sangre, que incluya la purificación de IgG.

Otras consideraciones de combinar etanol y agua pueden garantizarse con respecto a la desnaturalización de proteínas. Por ejemplo, si se añaden 500 ml de etanol (100%) a 500 ml de agua, no se obtienen 1000 ml de etanol al 50%. Más bien, el volumen final es aproximadamente 956 ml. Se supone que la reducción en volumen es debida a una estrecha unión entre el etanol y las moléculas del agua. Tal unión puede ser una causa de cambios en la configuración de las proteínas, produciendo alguna desnaturalización permanente de moléculas de proteína que sigue después de que el etanol se elimine y el agua se devuelva.

En los años 70 se encontró que la cromatografía era útil en la separación y purificación de proteínas del plasma. La cromatografía separa proteínas del plasma eligiendo específicamente como diana características únicas de cada una que incluyen tamaño molecular (filtración en gel) , carga (cromatografía de intercambio iónico) e interacciones conocidas con moléculas específicas (cromatografía de afinidad) .

El uso de diversos procedimientos cromatográficos a escala industrial se ha adaptado para el aislamiento de proteínas de alto valor de pequeño peso tales como el factor VIII, de plasma, y para la purificación final de gammaglobulina después de la separación del plasma por metodologías de Cohn o de Cohn modificadas. Sin embargo, no se ha encontrado práctica la separación cromatográfica de las fracciones de menor valor de gran peso tales como albúmina y gamma-globulina a escala industrial.

Dos solicitudes de patente de EE.UU., presentadas por Edward Shanbrom, que tienen los números de solicitud 20030022149 (Shanbrom '149) y 20030129167 (Shanbrom '167) presentadas el 30 de enero de 2003 y el 10 de julio de 2003, respectivamente, enseñan el uso de sales carboxílicas (por ejemplo, citrato de trisodio) como agente para potenciar la formación de un crioprecipitado de plasma. El (Los) procedimiento (s) de Shanbrom implica (n) generalmente citrato de trisodio y otras sales de citrato como agentes para potenciar la producción de factores de coagulación de la sangre partir del crioprecipitado.

Shanbrom '149 enseña en el párrafo 0009 que “Es un objeto de la presente invención proporcionar rendimientos potenciados de crioprecipitado”. Shanbrom también enseña en el párrafo 0011 que los ácidos carboxílicos son agentes eficaces para potenciar la producción de factores de coagulación de la sangre a partir del crioprecipitado. Shanbrom '149 observa que la adición de citrato a plasma, especialmente a concentraciones entre el dos y el diez por ciento en peso, no desnaturaliza apreciablemente proteínas lábiles. Además, en Shanbrom '149 se observa que el citrato potencia o mejora la destrucción de microorganismos por tratamiento térmico.

Shanbrom '167 observa en el párrafo 0015 que “No sólo el citrato añadido aumenta la cantidad de crioprecipitado, simplifica el procedimiento disminuyendo el requisito de congelar ...” plasma con el fin de recoger el crioprecipitado. Shanbrom enseña claramente el uso de la producción de un crioprecipitado con el fin de fraccionar productos del crioprecipitado mediante el uso de citrato de trisodio en concentraciones del dos al diez por ciento.

Mientras que Shanbrom '149 y '167 tratan directamente de extraer productos de coagulación lábiles de un crioprecipitado formado usando compuestos de citrato, particularmente citrato de trisodio, y de destruir los microorganismos en el crioprecipitado usando los compuestos de citrato, la presente invención trata directamente de extraer productos no lábiles (por ejemplo, albúmina, gamma-globulina y alfa-1-antitripsina) de un sobrenadante formado usando compuestos de sal. Shanbrom ni enseña ni trata de ningún modo el uso de un sobrenadante.

En los años 50, se descubrió que un “crioprecipitado” derivado de materia basada en sangre contenía diversos factores que eran útiles en el tratamiento de trastornos de la coagulación tales como hemofilia. Se obtuvo un crioprecipitado tal, como el nombre implica, congelando plasma sanguíneo seguido de descongelación controlada a cero a cuatro grados centígrados para formar una suspensión líquida del precipitado. Entonces, un sobrenadante derivado del procedimiento de crioprecipitación estuvo disponible para el fraccionamiento usando procedimientos según Cohn para producir albúmina y gamma-globulina. Desarrollos posteriores condujeron al fraccionamiento del crioprecipitado en concentrados puros del factor VIII, factor von Willebrand y otros factores de coagulación. Tal puede llevarse a cabo usando separaciones no alcohólicas y purificación cromatográfica.

Breve resumen y objetos de la invención En breve resumen, esta presente invención proporciona procedimientos novedosos y eficaces de aislar gammaglobulina de plasma y formularla en una preparación inyectable intravenosa. Por consiguiente, la presente invención, que puede definirse que es “una preparación de inmunoglobulina intravenosa de rendimiento ultra-alto” consigue rendimientos mayores de una gamma-globulina de calidad superior separando directamente y rápidamente la gamma-globulina del plasma por medio de un citrato de sodio precipitante no desnaturalizante. Una característica sorprendente del uso de esta sal es que el fraccionamiento depende de emplear una disolución de porcentaje en peso eficaz.

Por tanto, la adición de esta sal a la proteína en disolución demuestra ser no tan reactiva para la eliminación de agua como la adición de etanol por procedimientos previos. Un rápido aislamiento usando esta eliminación de sal del agua como adición de etanol por procedimientos previos. Un rápido aislamiento... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para el fraccionamiento de material basado en sangre para producir un producto de inmunoglobulina (IgG) intravenosa no desnaturalizada útil que comprende las etapas de:

(a) después de adquirir una cantidad predeterminada de material basado en sangre procesar y seleccionar una cantidad de plasma como material basado en sangre;

(b) preparar dicha cantidad de plasma congelando el plasma, seguido de descongelación controlada calentando gradualmente el plasma a cero a cuatro grados centígrados para formar un plasma descongelado en el que se suspende un crioprecipitado y separar el crioprecipitado para proporcionar un plasma crioempobrecido;

(c) efectuar una primera etapa de fraccionamiento en el plasma crioempobrecido añadiendo una primera cantidad predeterminada de citrato de sodio al plasma crioempobrecido para producir una primera concentración de citrato de sodio predeterminada de entre el once y el trece por ciento en peso en disolución para formar un primer producto de sobrenadante separable que tiene una concentración de citrato de sodio entre el once y el trece por ciento en peso en disolución y un primer producto de pasta residual en el que el primer producto de sobrenadante separable está sustancialmente libre de euglobulinas;

(d) separar el primer producto de sobrenadante separable del primer producto de pasta residual para completar la primera etapa de fraccionamiento;

(e) efectuar una segunda etapa de fraccionamiento en el primer producto de sobrenadante separable añadiendo una segunda cantidad predeterminada de citrato de sodio al primer producto de sobrenadante separable para producir una segunda concentración de citrato de sodio predeterminada de entre el veintiuno y el veintitrés por ciento en peso en disolución para formar un segundo producto de pasta separable y un segundo producto de sobrenadante residual que tiene una concentración de citrato de sodio entre el veintiuno y el veintitrés por ciento en peso en disolución,

(f) separar dicho segundo producto de pasta separable de dicho segundo producto de sobrenadante residual para completar la segunda etapa de fraccionamiento;

(g) preparar dicho segundo producto de pasta separable para la diafiltración; y

(h) diafiltrar dicho segundo producto de pasta separable para formar un menor volumen del tercer producto sustancialmente libre de citrato de sodio.

2. El procedimiento para el fraccionamiento de material basado en sangre según la reivindicación 1, en el que la etapa (g) comprende formar una dilución líquida de la segunda pasta separable combinando un volumen resultante de dicho segundo producto de pasta separable con un volumen de agua que tiene cuatro veces un peso medible resultante del segundo producto de pasta separable.

3. El procedimiento para el fraccionamiento de material basado en sangre según la reivindicación 1, en el que la etapa (c) comprende añadir una cantidad de citrato de sodio para producir una primera concentración de citrato de sodio predeterminada en peso en disolución del doce por ciento.

4. El procedimiento para el fraccionamiento de material basado en sangre según la reivindicación 1, en el que la etapa (e) comprende añadir una cantidad de citrato de sodio para producir una segunda concentración de citrato de sodio predeterminada en peso en disolución del veintidós por ciento.

5. El procedimiento para el fraccionamiento de material basado en sangre según la reivindicación 1 que comprende además una etapa adicional, que sigue a la etapa (e) , de fraccionar dicho segundo producto de sobrenadante residual en un grupo de productos que comprende albúmina y alfa-1-antitripsina.

6. El procedimiento para el fraccionamiento de material basado en sangre según la reivindicación 1, en el que otra etapa, que sigue a la etapa (g) , procesa dicho segundo producto de sobrenadante residual para separar albúmina y alfa-1-antitripsina.