Potenciamiento de la producción de etanol microbiana.

Una bacteria termófila del género Bacillus que carece de actividad de lactato deshidrogenasa y que tiene actividadde piruvato formiato liasa,

caracterizada porque la bacteria termófila contiene un gen que codifica una formiatodeshidrogenasa ligada a NAD.

Potenciamiento de la producción de etanol microbiana

Campo de la invención La presente invención se refiere a procedimientos de fermentación y microorganismos para su uso en ellos y en particular al potenciamiento de la producción de etanol microbiana. Más específicamente, la invención se refiere a la producción de etanol potenciada por bacterias termófilas tales como bacilos de azúcares mixtos derivados de la hidrólisis de biomasa. En particular, la invención prevé una ruta novedosa para la producción de etanol clonando un gen que codifica una enzima formiato deshidrogenasa ligada a NAD en una bacteria termófila del género Bacillus que posee un gen funcional que codifica un complejo de enzimas piruvato-formiato liasa pero que carece de actividad de lactato deshidrogenasa.

Antecedentes a la invención El bioetanol se prepara actualmente a partir de glucosa, maltosa o sacarosa derivada de almidón de cereal, caña de azúcar o remolacha azucarera, que todos tienen valor alimenticio. Las celulosas y hemicelulosas forman una parte importante de los subproductos agrícolas y podrían ser, en principio, una fuente importante de bioetanol renovable de bajo coste. Sin embargo, es difícil y caro derivar azúcares fermentables de la celulosa. A diferencia, las hemicelulosas son casi tan abundantes como la celulosa y son fáciles de hidrolizar, pero dan una mezcla de azúcares principalmente pentosa que no pueden fermentar levaduras.

Por este motivo, Hartley (véase la publicación internacional número WO 88/09379) propuso la producción de etanol por mutantes de un bacilo termófilo, que fermenta muy rápidamente todos los azúcares derivados de biomasa, a temperaturas de hasta 70ºC. Sin embargo, sólo se logra un alto rendimiento de etanol por células estresadas y moribundas.

Muchos microorganismos contienen una ruta de piruvato-formiato liasa (PFL) que convierte piruvato en acetil CoA y formiato (Figura 1A) . Los microorganismos fermentativos de heterolactato son una de tal clase. Estos microorganismos convierten primero los azúcares de entrada en piruvato (generalmente por la ruta de EMP de glucólisis) , que luego pueden tomar muchas rutas para producir lactato, formiato, acetato, etanol y CO2, en diversas proporciones, dependiendo de las condiciones de crecimiento.

En células completamente aerobias, el piruvato es normalmente metabolizado en H2O y CO2 por la ruta de piruvato deshidrogenasa (PDH) , ciclo de ácido tri-carboxílico y la cadena de transporte de electrones. Sin embargo, en muchos de estos organismos, particularmente bacilos termófilos, la captación de azúcares y la glucólisis parecen estar sin regular y el lactato es un producto dominante a altas concentraciones de azúcar, incluso bajo condiciones aerobias. Esto sugiere que el flujo de PDH se ha saturado, y que el piruvato en exceso es desviado a una ruta de lactato deshidrogenasa de exceso. Ésta no se usa para el crecimiento, pero produce calor que hace que se eleve la temperatura ambiente y destruya competidores mesófilos, como puede apreciarse cuando césped fresco se pone sobre una pila de compost.

Si el gen ldh (que codifica lactato deshidrogenasa) se inactiva como se describe, por ejemplo, en el documento WO 02/29030, se detiene la producción de lactato y el piruvato es exceso es principalmente desviado a la ruta de PFL ligada al crecimiento (Figura 1A) . Sin embargo, a concentraciones de azúcar muy altas y/o a pH ácido, el flujo de la ruta de PFL disminuye y entonces el piruvato en exceso se desborda a una ruta de PDH anaerobia, que sólo da etanol y CO2 (Figura 1B) . Por tanto, las condiciones preferidas para obtener altos rendimientos de etanol son aquellas que reducen el flujo por la ruta de PFL y aumentan el flujo por la ruta de PDH (Hartley, B.S. y Shama, G. Proc. Roy. Soc. Lond. 321, 555-568 (1987) ) . Desafortunadamente, bajo tales condiciones, las células experimentan tensión metabólica, con producción de ATP reducida, y un posible desequilibrio en las relaciones de NAD/NADH y CoA/acetil CoA (Figura 1C) .

Se han propuesto diversos protocolos de fermentación para intentar evitar o minimizar este problema tal como el de Hartley, B.S. como se trata anteriormente (véase la publicación internacional número WO 88/09379) .

Hay dos clases de formiato deshidrogenasa. Una (codificada por el gen fdhF) convierte formiato en CO2 + H2 y es típica de enterobacterias tales como E. coli. La otra (codificada por el gen fdh1) convierte formiato + NAD en CO2 + NADH2 y está presente en muchos anaerobios facultativos. Berrios-Rivera y col. (Metabolic Engineering 4, 217-219 (2002) ) sustituyeron el gen fdhF en E. coli con un gen fdh1 de levadura y encontraron que los productos anaerobios reducidos tales como etanol, lactato y succinato aumentaron con respecto a productos oxidados tales como acetato. Basándose en esta observación, San, K-Y. Berrios-Rivers, S.J. y Bennett, G.N. (véase la publicación internacional número WO 2003/040690) propusieron la introducción de un gen formiato deshidrogenasa ligada a NAD como procedimiento general para aumentar la potencia reductora en células que participaban en un amplio intervalo de bio-transformaciones. Posteriormente, San, K-Y. Bennett, G.N. y Sanchez, A. (solicitud de patente de EE.UU. 2005/0042736 A1) propusieron una aplicación específica de este concepto para la producción de succinato. Estos

estudios se llevaron a cabo en E. coli, un ejemplo de un mesófilo en el que la captación de azúcares está regulada. El fin de estos experimentos fue aumentar los niveles de NADH intracelular de manera que se proporcionara potencia reductora potenciada para las diversas bio-transformaciones.

La formiato deshidrogenasa de levadura recomendada por Sen. y col. (2004) es inactiva a 60ºC, que es la temperatura de crecimiento mínima para las bacterias termófilas potencialmente de uso en la producción de bioetanol. Las formiato deshidrogenasas más termoestables descritas hasta la fecha es la enzima 101 de Pseudomonas sp. (A. Rojkova, A. Galkin, L. Kulakova, A. Serov, P. Savitsky, V. Fedorchuk, V. Tishkov FEBS Letters, volumen 445, número 1, páginas 183-188, 1999) .

Resumen de la invención La presente invención intenta resolver los problemas de producir altos rendimientos de etanol a partir de biomasa. En particular, en el presente documento se ha descrito por primera vez una ruta metabólica novedosa que permite que microorganismos termófilos, especialmente bacterias tales como Bacillus, produzcan rendimientos de etanol máximos. La invención se define en las reivindicaciones.

La invención se basa en bacterias termófilas del género Bacillus que carecen de actividad de lactato deshidrogenasa y, por tanto, requieren una ruta alternativa para la re-oxidación de la NADH en exceso producida por glucólisis. Ésta se proporciona por introducción en las bacterias termófilas del género Bacillus de un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD, tal como un gen fdh1. En microorganismos termófilos, y a diferencia de mesófilos tales como E. coli, la captación de azúcares están sin regular y esto conduce a la acumulación de NADH en presencia de altos niveles de azúcares. Esto conduce eventualmente a un colapso metabólico y a la llamada “muerte rédox” como se muestra esquemáticamente en la Figura 1C. La incorporación en el microorganismo de un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD ayuda a prevenir la muerte celular a altas concentraciones de azúcar conduciendo a una disminución en niveles de NADH y a un aumento en niveles de NAD. Esto es en parte restaurando un flujo por la ruta de piruvato deshidrogenasa (PDH) , pero, y lo que es más importante, la inclusión de un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD crea una novedosa ruta de piruvato formiato liasa (PFL) -formiato deshidrogenasa ligada a NAD (FDH) para la producción de etanol. La Figura 1D muestra las posibilidades de esta ruta de PFL-FDH para restaurar el equilibrio rédox convirtiendo todo el piruvato producido por la rápida glucólisis en presencia de altos niveles de azúcar en etanol y CO2, especialmente bajo condiciones de pH neutro. Y, lo que es más importante, la ruta opera en condiciones que son opcionales para el crecimiento celular, conduciendo a la rápida producción de etanol y alto rendimiento, ya que la ruta de PFL es la principal ruta anaerobia ligada al crecimiento en microorganismos termófilos.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención proporciona una bacteria termófila del género Bacillus que carece de actividad de lactato deshidrogenasa (ldh) , caracterizada porque la bacteria termófila contiene un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD (fdh) .

En una realización, el microorganismo... [Seguir leyendo]

1. Una bacteria termófila del género Bacillus que carece de actividad de lactato deshidrogenasa y que tiene actividad de piruvato formiato liasa, caracterizada porque la bacteria termófila contiene un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD.

2. La bacteria termófila de la reivindicación 1, en la que el gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD está integrado en el genoma de la bacteria termófila.

3. La bacteria termófila de la reivindicación 1 ó 2, en la que el gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD se expresa a partir de su propio promotor o a partir de un promotor de la bacteria termófila.

4. La bacteria termófila de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD se inserta en el gen lactato deshidrogenasa de la bacteria termófila, inactivándose así la actividad de lactato deshidrogenasa de la bacteria termófila.

5. La bacteria termófila de cualquier reivindicación precedente, en la que el gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD comprende la secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 1 ó 2.

6. La bacteria termófila de cualquier reivindicación precedente que ha sido transformada con una construcción de ADN que comprende un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD operativamente ligado a una región en la dirección 5' de un gen que codifica una lactato deshidrogenasa, en la que la región en la dirección 5' incluye el promotor y que comprende además al menos parte del gen lactato deshidrogenasa en la dirección 3' del gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD de forma que el gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD está interpuesto entre una porción suficiente del gen lactato deshidrogenasa sobre cualquier lado para facilitar la integración del gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD por recombinación con un gen lactato deshidrogenasa en el genoma de la bacteria termófila.

7. Un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD termoestable que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 1.

8. Una construcción de ADN que comprende una secuencia reguladora operativamente ligada a un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD termoestable que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 1.

9. Una construcción de ADN que comprende un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD, opcionalmente una formiato deshidrogenasa ligada a NAD termoestable, y un elemento de ADN transponible que puede integrarse en el genoma de una bacteria termófila del género Bacillus que facilita la integración del gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD en el genoma de la bacteria termófila transformado con la construcción de ADN.

10. Una construcción de ADN que comprende un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD, opcionalmente una formiato deshidrogenasa ligada a NAD termoestable, operativamente ligado a una región en la dirección 5' de un gen que codifica una lactato deshidrogenasa, en la que la región en la dirección 5' incluye el promotor.

11. Una bacteria termófila del género Bacillus que comprende la construcción de ADN como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.

12. Uso de una bacteria termófila como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o según la reivindicación 11 para la producción de etanol.

13. Un proceso de fermentación para la producción de etanol que comprende suministrar una bacteria termófila como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o según la reivindicación 11 con azúcares.