Polinucleótidos y su uso para obtener plantas resistentes a virus.

La presente invención se refiere a secuencias nucleotídicas de elF4E utilizadas para la formación de un ARN de interferencia y su uso para silenciar específicamente el factor de iniciación de la traducción elF4E pero no a su isoforma, el factor elF(iso)4E, obteniendo de esta manera plantas resistentes a al menos un tipo de virus o que mejoran su resistencia al mismo, respecto de un control.

Polinucleótidos y su uso para obtener plantas resistentes a virus

La presente invención se encuadra dentro del campo del sector de biotecnología de plantas, en concreto, la presente invención se refiere a secuencias nucleotídicas de elF4E utilizadas para la formación de un ARN de interferencia y su uso para silenciar específicamente el factor de iniciación de la traducción elF4E pero no a su isoforma, el factor eIF (iso) 4E, obteniendo de esta manera plantas resistentes a al menos un tipo de virus o que mejoran su resistencia al mismo, respecto de un control.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La gran mayoría de los ARN mensajeros (mRNAs) de eucariotas tienen un grupo m7G (estructura cap) en su extremo 5' y una cola poli (A) en su extremo 3'. La interacción de estos extremos con factores de iniciación de la traducción (eIF) es importante para una traducción eficiente. En células de plantas se han identificado dos complejos de unión a la estructura cap, elF4F y eIF (iso) 4F. El primero está formado por eIF4E, una proteína pequeña de unión a estructuras cap, y eIF4G, una proteína grande que interacciona con otros factores de iniciación, incluyendo la proteína de unión a poli (A) (PABP) , elF4A y el factor elF3 (Browning, 2004. Biochem. Soco Trans., 32: 589-591) . La interacción entre elF4F y el mRNA está propuesta como el primer paso de la iniciación de la traducción, en el cual elF4E provee la función de unión del 5'-cap durante la formación del complejo de iniciación en la mayoría de los mRNAs eucarióticos. Para una traducción eficiente es adicionalmente necesaria la circularización del mRNA (Kawaguchi y Bailey-Serres, 2002. Curr. Op. Plant Biol., 5: 460-465) a través de una triple interacción en la cual elF4G actúa como andamio, interaccionando con elF4E y PABP. Como eIF4F, también eIF (iso) 4F se compone de dos subunidades, la pequeña de unión a cap es eIF (iso) 4E, y la subunidad grande eIF (iso) 4G. elF4F y eIF (iso) 4F tienen actividades similares in vitro (Browning, 1996. Plant Mol. Biol., 32: 107-144) Y existe evidencia de que las dos son funcionalmente intercambiables, pero son capaces de diferenciar entre diferentes mRNAs in vitro. Mientras eIF (iso) 4F media preferentemente la traducción de mRNAs no estructurados, elF4F puede mediar la traducción de mRNAs sin cap y estructurados (Gallie y Browning, 2001. J. Biol. Chem., 276: 36951-36960) . Experimentos in vivo también han permitido proponer que tiene que haber cierto grado de redundancia funcional para las funciones de eIF4E, ya que mutantes de Arabidopsis thaliana (arabidopsis) y pimiento que carecen de una de las dos isoformas no muestran ningún fenotipo y la expresión de la isoforma funcional suele estar incrementada (Duprat et al., 2002. The Plant Journal, 32: 927-934; Yoshii et al., 2004. Journal of Virology, 78: 6102-6111; Sato et al., 2005. FEBS Let!., 579: 1167-1171; Ruffel et al., 2006. J. Gen. Viral.,

87: 2089-2098) . Por ejemplo, un mutante knock-out de eIF (iso) 4E de arabidopsis, que no produce esta proteína, es aparentemente normal (y resistente a diversos virus) y expresa mayor cantidad de elF4E (Duprat y col., 2002) . Por otro lado, Combe y colaboradores (Combe et al., 2005. Plant Molecular Biology, 57: 749-760) han estudiado la reducción simultánea de la expresión de elF4E y eIF (iso) 4E en tabaco , que resultó en plantas con enanismo. Aparte de este papel fundamental en la iniciación de la traducción, elF4E se acumula en el núcleo en cuerpos nucleares (nuclear bodies) , donde se ha demostrado que está involucrado en la exportación de varios mRNAs que contienen una estructura denominada 4E-sensitivity element (Goodfellow y Roberts, 2008. J. Biochem. &Cell Biol., 40: 2675-2680) .

En relación con la infección de células de plantas por virus, el clonaje y caracterización de genes recesivos de resistencia a virus del huésped ha señalado a los factores de la familia elF4E como factores de susceptibilidad requeridos por una amplia gama de virus (Robaglia y Caranta, 2006. Trends in Plant Science, 11: 40-45; Truniger y Aranda, 2009. Recessive Resistance to Plant Viruses. In Advances in Virus Research: Academic Press, pp. 119-159, 231) . Entre los virus para los cuales elF4E o su isoforma son esenciales para su multiplicación figuran varios virus pertenecientes a la familia Potyviridae en diferentes huéspedes, pero también algunos virus de otras familias, como por ejemplo el virus de las manchas necróticas del melón (MNSV; Nieto et al., 2006. The Plant Journal, 48: 452-462) o el virus del mosaico del pepino (CMV; Yoshii et al., 2004. Journal of Virology, 78: 6102-6111) . Al contrario de las funciones solapantes de estas isoformas en la traducción de genes del huésped, sus funciones no suelen ser solapantes en el ciclo de infección viral. Así los virus muestran una notable especificidad por cada una de las isoformas de eIF4E, ya que la falta de una de ellas puede llevar a su incapacidad de multiplicarse (Truniger y Aranda, 2009. Recessive Resistance to Plant Viruses. In Advances in Virus Research: Academic Press, pp. 119-159, 231) .

La familia de elF4E se compone de dos o más isoformas, muy conservadas entre diferentes organismos. En arabidopsis, se conocen tres genes que codifican proteínas de la subfamilia elF4E (eIF4E1, elF4E2 y eIF4E3) , un gen que codifica eIF (iso) 4E (base de datos de secuencias de arabidopsis TAIR) y un gen de menor homología con las anteriores que codifica una proteína de unión a cap denominada nCBP (novel cap-binding protein) (Ruud et al., 1998.

J. Biol. Chem., 273: 10325-10330) . En todas las especies de plantas en las que se tiene suficiente información se han identificado varias isoformas de elF4E (Joshi et al., 2005. BMC Evolutionar y Biology, 5: 48; Charron et al., 2008. The Plant Journal, 54: 56-68) . En melón se ha identificado un gen que codifica eIF4E, uno que codifica eIF (iso) 4E y un tercer gen con homología a nCBP de arabidopsis (González-Ibeas et al., 2007. BMC Genomics, 8: 306) .

El silenciamiento génico post-transcripcional es un proceso que consiste en una degradación específica dependiente de secuencia de ARN, que lleva a una supresión específica de la expresión génica. El silenciamiento génico es inducido por ARN de doble cadena (dsRNA) y mediado por pequeños ARNs interferentes (siRNA) . Este proceso ha sido aprovechado para el estudio de funciones de genes a través de la reducción de su expresión. Wesley y colaboradores (Wesley et al., 2001. The Plant Journal, 27: 581-590) llevaron a cabo un estudio sobre el diseño de construcciones para obtener un silenciamiento efectivo y eficiente, para conseguir reducir la expresión de genes específicos. Concluyeron que con construcciones de ARN tipo hairpin se obtenía la mayor eficiencia, estando el 90% de las plantas transformadas silenciadas para el transgén (Wesley et al., 2001. The Plant Journal, 27: 581590) . Pero los siRNAs, aparte de inducir el silenciamiento específico también pueden tener efectos no específicos sobre la expresión de otras proteínas nodianas dependiendo esto de la secuencia del siRNA (Scacheri et al., 2004. PNAS, 101, 1892-1897; Jackson y Linsley, 2004. Trends in Genetics, 20: 521524) . Así, se ha demostrado que puede haber silenciamiento indirecto (no dirigido) en transcritos que son complementarios a tan solo 11 nucleótidos (nts) seguidos del total de 21 nts de los sRNAs (Jackson et al., 2003. Nat Biotech,

21: 635-637) .

La infección por virus de las plantas generalmente conlleva la reducción en el crecimiento vegetal, disminución del rendimiento, menor calidad y pérdidas económicas. En la actualidad continúa la búsqueda de herramientas que permitan controlar la infección de las plantas por los virus o, preferiblemente la obtención de plantas resistentes a dichos virus para mejorar el rendimiento y la calidad de los frutos producidos por dichas plantas, evitando así las pérdidas económicas y la dificultad de abastecimiento de alimentos en zonas productoras deprimidas.

EXPLICACiÓN DE LA INVENCiÓN

La presente invención provee secuencias nucleotídicas utilizadas para la formación de un ARN de interferencia capaz de silenciar de forma específica al factor de iniciación de la traducción eIF4E, pero no su isoforma eIF (iso) 4E, permitiendo con ello obtener plantas resistentes a al menos un tipo de virus o que mejoran su resistencia al mismo, respecto de un control.

En la presente invención se aborda la obtención de líneas transgénicas de melón cuya expresión de elF4E está reducida, para generar plantas más resistentes a diferentes tipos de virus. Para ello... [Seguir leyendo]

1. Polinucleótido aislado que expresa al menos un ARN de interferencia, donde dicho polinucleótido es SEO ID NO: 2.

2. Secuencia nucleotídica aislada que comprende el polinucleótido según la reivindicación 1, donde:

a. dicha secuencia tiene la estructura A-B,

b. A es SEO ID NO: 2, y

c. B es SEO ID NO: 3

3. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 2, donde además comprende una secuencia nucleotídica espaciadora situada entre A y B.

4. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 3, donde la secuencia nucleotídica espaciadora es un intrón o un fragmento de dicho intrón.

5. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 4, donde el intrón es SEO ID NO:4.

6. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 5, donde dicha secuencia es SEO ID NO: 5.

7. ARN tipo hairpin, transcrito a partir de la secuencia según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6.

8. ARN de interferencia generado a partir de la secuencia de ARN tipo hairpin según la reivindicación 7.

9. Vector de expresión que comprende el polinucleótido según la reivindicación 1, o la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6.

10. Célula aislada que comprende el polinucleótido según la reivindicación 1; la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6; el ARN según cualquiera de las reivindicaciones 7 ó 8; o el vector según la reivindicación 9.

11. Planta que comprende el polinucleótido según la reivindicación 1; la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6; el ARN según cualquiera de las reivindicaciones 7 ó 8; el vector según la reivindicación 9 o la célula según la reivindicación 10.

12. Planta según la reivindicación 11 , donde dicha planta es del género

Cucumis.

13. Planta según la reivindicación 12, donde dicha planta es de la especie

Cucumis me/o.

14. Fruto de la planta según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13.

15. Semilla o germoplasma de la planta según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13.

16. Uso del polinucleótido según la reivindicación 1; la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6; el ARN según cualquiera de las reivindicaciones 7 ó 8; el vector según la reivindicación 9 o la célula según la reivindicación 10, para mejorar la resistencia de al menos una planta a al menos un virus, respecto de un control.

17. Uso según la reivindicación 16, donde la planta es del género Cucumis.

18. Uso según la reivindicación 17, donde la planta es de la especie

Cucumis mela.

19. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, donde el virus se selecciona de la lista que comprende el virus de las manchas necróticas del melón (MNSV) , el virus del mosaico amarillo del calabacín o el virus del mosaico de la sandía.

20. Uso del polinucleótido según la reivindicación 1; la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6; el ARN según cualquiera de las reivindicaciones 7 ó 8; del vector o célula que comprende el polinucleótido según la reivindicación 1, para obtener al menos una planta de la especie Cucumis mela resistente al virus MNSV.

21. Método para obtener al menos una planta de la especie Cucumis mela, resistente al virus MNSV, que comprende:

a. transformar al menos una célula de la planta de la especie Cucumis mela con el vector de expresión que comprende el polinucleótido según la reivindicación 1, o la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6,

b. seleccionar la célula transformada que comprende el vector transformado según el paso (a) ,

c. obtener al menos una planta resistente al virus MNSV a partir de la célula según el paso (b) .

22. Método según la reivindicación 21, donde el vector comprende el polinucleótido según la reivindicación 2.

23. Método según la reivindicación 22, donde el vector comprende la secuencia nucleotídica según la reivindicación 6.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> consejo superior de Investigaciones Científicas

<120> Polinucleótidos y su uso para obtener plantas resistentes a virus

<130> Es1641. 743

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 925

<212> DNA

<213> Cucumis melo

<400> 1 ggaagcccaa gggataaagg ttttaagtcg aaaattgtac cacaaaaggc cgactcaaac 60 gcctaacaga aaatccgagg gcggtgccat tcttcttcgg ttccttccct tccattgatt 120 cgattcttca gataactctc cattccacaa agcactgaaa acccaaaatg gtagttgaag 180 attcgatgaa agctacatcg gcggaagatc tttctaattc cattgctaat caaaacccta 240 gaggacgtgg cggtgacgaa gatgaggaac ttgaggaagg tgagatcgtc ggcgacgacg 300 acctcgactc ctccaatttg tccgcgtccc tagtgcatca gcctcaccct ctggagcact 360 cttggacctt ttggttcgat aacccatctg ccaaatccaa gcaagccacc tggggtgcgt 420 ctattcgacc gatctatacc ttctctaccg tcgaggagtt ctggagtgtt tacaacaaca 480 ttcatcatcc aagcaaattg gcgatgaggg cagatttgta ctgcttcaaa cataaaattg 540 agcctaaatg ggaagatccc gtttgtgcta atggagggaa atggactgtg aactttccaa 600 ggggaaaatc tgataatggc tggttgtaca cgctgcttgc tatgatcgga gaacagtttg 660 actgtggtga tgaaatttgt ggagcagttg ttaatgttag gtctgggcag gataaaatat 720 caatttggac gaagaatgct tccaatgaag ctgcgcaggc gagcattgga aaacagtgga 780 aggagtttct tgattacaat gagagcattg gctttatatt ccacgatgac gcaaagaaat 840 tcgatagaca tgcgaagaat aaatatatgg tgtgatctgt acggtttcta gtgcgtggcg 900 tgggaggagg ataactcgtc ctatt 925

<210> 2

<211> 175

<212> DNA

<213> Cucumis melo

<400> 2 gtagttgaag attcgatgaa agctacatcg gcggaagatc tttctaattc cattgctaat 60 caaaacccta gaggacgtgg cggtgacgaa gatgaggaac ttgaggaagg tgagatcgtc 120 ggcgacgacg acctcgactc ctccaatttg tccgcgtccc tagtgcatca gcctc 175

<210> 3

<211> 175

<212> DNA

<213> Cucumis melo

1

<400> 3 gaggctgatg cactagggac gcggacaaat tggaggagtc gaggtcgtcg tcgccgacga 60 tctcaccttc ctcaagttcc tcatcttcgt caccgccacg tcctctaggg ttttgattag 120 caatggaatt agaaagatct tccgccgatg tagctttcat cgaatcttca actac 175

<210> 4

<211> 829

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Intron pdk + polilinker

<400> 4 ggatccgaat tcggtacccc aattggtaag gaaataatta ttttcttttt tccttttagt 60 ataaaatagt taagtgatgt taattagtat gattataata atatagttgt tataattgtg 120 aaaaaataat ttataaatat attgtttaca taaacaacat agtaatgtaa aaaaatatga 180 caagtgatgt gtaagacgaa gaagataaaa gttgagagta agtatattat ttttaatgaa 240 tttgatcgaa catgtaagat gatatactag cattaatatt tgttttaatc ataatagtaa 300 ttctagctgg tttgatgaat taaatatcaa tgataaaata ctatagtaaa aataagaata 360 aataaattaa aataatattt ttttatgatt aatagtttat tatataatta aatatctata 420 ccattactaa atattttagt ttaaaagtta ataaatattt tgttagaaat tccaatctgc 480 ttgtaattta tcaataaaca aaatattaaa taacaagcta aagtaacaaa taatatcaaa 540 ctaatagaaa cagtaatcta atgtaacaaa acataatcta atgctaatat aacaaagcgc 600 aagatctatc attttatata gtattatttt caatcaacat tcttattaat ttctaaataa 660 tacttgtagt tttattaact tctaaatgga ttgactatta attaaatgaa ttagtcgaac 720 atgaataaac aaggtaacat gatagatcat gtcattgtgt tatcattgat cttacatttg 780 gattgattac agttgggaaa ttgggttcga aatcgataag cttggatcc 829

<210> 5

<211> 1179

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> SEQ ID NO: 2 + SEQ ID NO:

<400> 5

4 + SEQ ID NO: 3

gtagttgaag attcgatgaa agctacatcg gcggaagatc tttctaattc cattgctaat 60 caaaacccta gaggacgtgg cggtgacgaa gatgaggaac ttgaggaagg tgagatcgtc 120 ggcgacgacg acctcgactc ctccaatttg tccgcgtccc tagtgcatca gcctcggatc 180 cgaattcggt accccaattg gtaaggaaat aattattttc ttttttcctt ttagtataaa 240 atagttaagt gatgttaatt agtatgatta taataatata gttgttataa ttgtgaaaaa 300 ataatttata aatatattgt ttacataaac aacatagtaa tgtaaaaaaa tatgacaagt 360

2

gatgtgtaag acgaagaaga taaaagttga gagtaagtat attattttta atgaatttga 420 tcgaacatgt aagatgatat actagcatta atatttgttt taatcataat agtaattcta 480 gctggtttga tgaattaaat atcaatgata aaatactata gtaaaaataa gaataaataa 540 attaaaataa tattttttta tgattaatag tttattatat aattaaatat ctataccatt 600 actaaatatt ttagtttaaa agttaataaa tattttgtta gaaattccaa tctgcttgta 660 atttatcaat aaacaaaata ttaaataaca agctaaagta acaaataata tcaaactaat 720 agaaacagta atctaatgta acaaaacata atctaatgct aatataacaa agcgcaagat 780 ctatcatttt atatagtatt attttcaatc aacattctta ttaatttcta aataatactt 840 gtagttttat taacttctaa atggattgac tattaattaa atgaattagt cgaacatgaa 900 taaacaaggt aacatgatag atcatgtcat tgtgttatca ttgatcttac atttggattg 960 attacagttg ggaaattggg ttcgaaatcg ataagcttgg atccgaggct gatgcactag 1020 ggacgcggac aaattggagg agtcgaggtc gtcgtcgccg acgatctcac cttcctcaag 1080 ttcctcatct tcgtcaccgc cacgtcctct agggttttga ttagcaatgg aattagaaag 1140 atcttccgcc gatgtagctt tcatcgaatc ttcaactac 1179

<210> 6

<211> 940

<212> DNA

<213> Cucumis mela

<400> 6 tattgatcga taatttccct tttcttaccc ccaattcatt ctagggggta ttttcagcgc 60 ccaagatatg gccggtgagg tagcggtgga gggtgctgtg gcggtggcgg cggcggcgtc 120 agaagtggcc gattccaatc cgcagtccca taaattggag agaaaatgga ccttttggtt 180 tgataaccag tccaggccga agcaaggtgc tgcctggggc acctctcttc gcaaggtcta 240 taccttcgaa accgtcgaag aattttggtg tttgtacgat cagttattca agccaagcaa 300 gttaccggcg aatgcagatt ttcacctgtt caaaactgga gttgaaccga aatgggaaga 360 tcccgagtgc gctaatggag gaaaatggac tgtcaccagc agtagaaagg ctaaccttga 420 taacatgtgg ctggaaacgt tgatggcttt gattggggaa caatttgagg agtctgatga 480 gatctgtggc gtagttgcca gtgtgcgcca gaggcaggac aaacttgctc tgtggaccaa 540 gacagcaaca aacgaggctg ctcagatgag cattggtagg aaatggaagg agattatcga 600 cgtaaatgac aagatttcct tcagctttca tgaggatttg agaagggaaa agtcagcaaa 660 agctcgatac agtgtttgat cattaactgc atcatgtcga gctgctaaat tttgaggaag 720 atactaaaca atatattttc gacatacttg tcattgttac atttcttttc ttctttgggt 780 ttgtttttta tttcaagacg aatcaattaa gatctttcat gttttgaaga atgcgcagaa 840 ttttccttca atgtagtagc cttgtcaatt tattatttag atccgttcct attgagaaat 900 atactgatat tatgtataat taattgtatt gtatgtttac 940

3

<210> 7

<211> 291

<212> DNA

<213> Cucumis melo

<400> 7 gcattggtag gaaatggaag gagattatcg acgtaaatga caagatttcc ttcagctttc 60 atgaggattt gagaagggaa aagtcagcaa aagctcgata cagtgtttga tcattaactg 120 catcatgtcg agctgctaaa ttttgaggaa gatactaaac aatatatttt cgacatactt 180 gtcattgtta catttctttt cttctttggg tttgtttttt atttcaagac gaatcaatta 240 agatctttca tgttttgaag aatgcgcaga attttccttc aatgtagtag c 291

<210> 8

<211> 1411

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> SEQ ID NO: 7 + SEQ ID NO: 4 + Secuencia invertida ycomplementaria de SEQ ID NO: 7

<400> 8 gcattggtag gaaatggaag gagattatcg acgtaaatga caagatttcc ttcagctttc 60 atgaggattt gagaagggaa aagtcagcaa aagctcgata cagtgtttga tcattaactg 120 catcatgtcg agctgctaaa ttttgaggaa gatactaaac aatatatttt cgacatactt 180 gtcattgtta catttctttt cttctttggg tttgtttttt atttcaagac gaatcaatta 240 agatctttca tgttttgaag aatgcgcaga attttccttc aatgtagtag cggatccgaa 300 ttcggtaccc caattggtaa ggaaataatt attttctttt ttccttttag tataaaatag 360 ttaagtgatg ttaattagta tgattataat aatatagttg ttataattgt gaaaaaataa 420 tttataaata tattgtttac ataaacaaca tagtaatgta aaaaaatatg acaagtgatg 480 tgtaagacga agaagataaa agttgagagt aagtatatta tttttaatga atttgatcga 540 acatgtaaga tgatatacta gcattaatat ttgttttaat cataatagta attctagctg 600 gtttgatgaa ttaaatatca atgataaaat actatagtaa aaataagaat aaataaatta 660 aaataatatt tttttatgat taatagttta ttatataatt aaatatctat accattacta 720 aatattttag tttaaaagtt aataaatatt ttgttagaaa ttccaatctg cttgtaattt 780 atcaataaac aaaatattaa ataacaagct aaagtaacaa ataatatcaa actaatagaa 840 acagtaatct aatgtaacaa aacataatct aatgctaata taacaaagcg caagatctat 900 cattttatat agtattattt tcaatcaaca ttcttattaa tttctaaata atacttgtag 960 ttttattaac ttctaaatgg attgactatt aattaaatga attagtcgaa catgaataaa 1020 caaggtaaca tgatagatca tgtcattgtg ttatcattga tcttacattt ggattgatta 1080 cagttgggaa attgggttcg aaatcgataa gcttggatcc gctactacat tgaaggaaaa 1140 ttctgcgcat tcttcaaaac atgaaagatc ttaattgatt cgtcttgaaa taaaaaccaa 1200 acccaaagaa gaaaagaaat gtaccaatga caagtatgtc gaaaatatat tgtttagtat 1260

4

cgcacaatcc cactatcctt e 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Cucumis mela

<400> 16 ccacgtcctc tagggttttg 20

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> Cucumis mela

<400> 17 gccccaggga aatcctagaa t 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> Cucumis mela

<400> 18 ccgctgtcac cacgttcttt a 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Cucumis mela

<400> 19 ttcggttcct tcccttccat 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Cucumis mela

<400> 20 ccgccgatgt agctttcatc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Cucumis mela

<400> 21 ggtattttca gcgcccaaga 20

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> Cucumis mela

<400> 22 ccaatttatg ggactgcgga t 21

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> Cucumis mela

<400> 23 cgatgtggaa attgacggaa

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> Cucumis mela

<400> 24 cggtgcataa tgctcggaa

7