Plásmido con acción inmunológica.

Un plásmido recombinante que tiene la secuencia SEC ID Nº 1.

Plásmido con acción inmunológica El objeto de la presente invención está representado mediante un plásmido recombinante utilizable para la transfección de células eucariotas y procariotas, que tienen la secuencia SEC ID Nº 1. Un objeto adicional de la invención está representado mediante el uso del plásmido mencionado anteriormente para la preparación de una formulación farmacéutica, o de una vacuna o un tratamiento terapéutico, para inducir una respuesta inmunitaria en un organismo humano.

En particular, se describe y se reivindica una secuencia de bases que se usan para la construcción de un plásmido que puede usarse:

- en un proceso de transfección de células procariotas o eucariotas (ex vivo) que pueden inocularse en 15 organismos superiores para inducir una respuesta inmunitaria profiláctica o terapéutica (por medio del plásmido 1 que tiene la secuencia SEC ID Nº 1) ;

También se proporciona una descripción de un perfil de patologías que pueden tratarse con los plásmidos descritos.

Estado de la técnica Puede usarse ADN de origen plasmídico para la transfección de células procariotas y eucariotas a través de métodos conocidos. Los plásmidos construidos para este fin están constituidos generalmente por un esqueleto que tiene unidades insertadas de material genético que codifican cierta proteína que puede estar o no provista de su propia actividad biológica.

Los plásmidos pueden ser de origen comercial, en los que una parte que porta la especificidad se introduce en una construcción estructural que ya se conoce y se usa, o generarse de forma autónoma, es decir, ensamblando fragmentos de material genético seleccionado en base a cierto perfil a reconstruir en el organismo al que está destinado el plásmido.

La síntesis de un plásmido es una operación de importancia fundamental para el fin de obtener las propiedades celulares deseadas. Los plásmidos determinan la eficacia de la transfección y de la síntesis de la proteína transgénica, y también la seguridad de la transfección y, por lo tanto, en el análisis final la eficacia resultante de la expresión proteica de la célula transfectada.

Un plásmido es un vector de datos genéticos que influyen en el ciclo celular de la célula huésped y, por consiguiente, el ciclo vital del organismo que aloja a estas células transfectadas: cuantos más datos se hayan introducido en el plásmido, más riesgos se corren durante la transfección.

Un plásmido se caracteriza por la especificidad de los datos contenidos: cuanto menos complejo sea, más fácil será su síntesis y más seguro será su uso.

Un plásmido ejerce la capacidad de transfectar una población celular de forma más o menos espontánea 45 dependiendo del tipo de célula y las condiciones experimentales de contacto/incubación en las que se realiza la transfección. Cuanto más selectivo sea un plásmido para una población celular específica, más utilizable es en condiciones de seguridad.

Las condiciones en las que se realiza la transfección son decisivas para el éxito de la misma: la homogeneidad y la concentración de las células a transfectar, el tiempo y las condiciones de incubación, la posibilidad de monitorizar el fenómeno con métodos específicos y selectivos constituyen un corolario extremadamente importante para el éxito de la operación.

En el caso específico en el que un plásmido se usa para transfectar células a inyectar in vivo en pacientes, dichas 55 células deben manipularse con extremo cuidado en la medida en que deben reinsertarse en el paciente, y no se pueden permitir fenómenos de riesgo y colaterales fatales: cuanto menos manipulación sea necesaria, mayor será la seguridad del método y más reproducible será el resultado.

A partir de lo anterior, es inevitable que el uso de un plásmido de dimensiones reducidas, especialmente si se combina con un método con manipulación limitada, sea una condición preferida en la transfección usada con fines profilácticos y terapéuticos.

El uso de un plásmido que codifica epítopos inmunógenos en un método de transfección autóloga es uno de los sistemas que pueden usarse para inducir una respuesta inmunitaria específica en algunas patologías caracterizadas 65 por la aparición de agentes infecciosos, o por mutación celular espontánea o inducida (carcinogénesis) , con modificación del ciclo apoptótico de una célula o línea celular seleccionada.

El documento WO 90/09804 describe inmunoglobulinas manipuladas genéticamente para expresar un epítopo peptídico predefinido en la región variable o en el dominio de unión de la inmunoglobulina.

El documento WO 00/61766 describe antígenos tumorales obtenidos de telomerasis que pueden usarse para generar una respuesta mediada por células T contra telomerasis y, por consiguiente, contra el propio tumor.

El documento WO 00/64488 describe un plásmido que codifica cadena pesada quimérica de una inmunoglobulina, el plásmido pNγ1VH62, que se obtiene subclonando el gen murino VH62 en el plásmido pNγ1, que contiene una secuencia que codifica una región constante γ1 humana. Este plásmido puede modificarse mediante la introducción de epítopos heterólogos en cualquiera de las regiones determinantes de la complementariedad de la región variable. Por lo tanto, se describe su uso en un método para inducir una respuesta inmunitaria.

Sin embargo, el plásmido pNγ1VH62 contiene partes que serán perjudiciales si este plásmido se inyectara en seres 15 humanos. Además, las dimensiones de este plásmido son tales que se obtiene un rendimiento de transfección muy bajo.

Descripción de la invención Los inventores de la presente invención han desarrollado actualmente un plásmido que comprende una secuencia que codifica la cadena pesada de inmunoglobulina que no presenta las desventajas del plásmido pNγ1VH62 cuando se usa para inducir una respuesta inmunitaria in vivo o ex vivo en un organismo humano. En particular, los plásmidos desarrollados tiene un mejor perfil de seguridad y muestran un mayor rendimiento cuando se transfectan en células.

Este plásmido tiene una longitud de 9727 pb y es capaz de expresar la cadena pesada de inmunoglobulina cuando se transfectan en linfocitos.

El plásmido expresa una cadena pesada quimérica de inmunoglobulina, que comprende preferiblemente una región 30 variable murina y una región constante humana, preferiblemente Igγ1.

La región variable murina es la región VH del hibridoma 62 obtenido de esplenocitos de un ratón adulto hiperinmunizado (Zanetti et al., J. Immunol., 1983, 131: 2452) , denominada en lo sucesivo en este documento región VH62.

El hibridoma 62 de VH62 secreta un anticuerpo monoclonal con actividad anti-tiroglobulina.

El gen de la región Igγ1 se clona del vector pNγ1.

El plásmido contiene además un promotor específico para células linfocíticas, preferiblemente de aproximadamente 50 pb.

El plásmido de la invención también comprende la secuencia de poliadenilación AATAAA.

45 El plásmido de la invención no expresa resistencia a antibióticos betalactámicos y en particular a ampicilina, y/o no comprende un origen de replicación de SV40.

Por consiguiente, el plásmido contiene un origen de replicación de Escherichia coli, que es PBR322. Además, el plásmido expresa resistencia a neomicina. 50 El plásmido de la invención es el plásmido 1 que tiene una longitud de 9727 pb (SEC ID Nº 1 y figura 1) .

El plásmido descrito codifica una cadena pesada quimérica de inmunoglobulina.

55 El esqueleto del plásmido está representado mediante pSV2neo, un ADN de origen bacteriano que contiene el gen para resistencia a neomicina y el origen de replicación PBR322.

La secuencia genética que codifica la cadena pesada de inmunoglobulina está compuesta por:

60 -una región variable murina (VH62) de aproximadamente 2, 5 kb, originalmente clonada a partir de un hibridoma de ratón (hibridoma 62) que secreta un anticuerpo monoclonal con actividad anti-tiroglobulina (Sollazzo, et. al., Eur. J. Immunol., 1989) ;

- una región constante de Igγ1 humana que se obtiene del vector pNγ1 (Hybritech Corporation, San Diego, CA) .

El promotor de inmunoglobulina del plásmido 1 es una parte integrante de VH62. El... [Seguir leyendo]

1. Un plásmido recombinante que tiene la secuencia SEC ID Nº 1.

2. Una formulación que contiene el plásmido de acuerdo con la reivindicación 1, junto con excipientes y/o coadyuvantes farmacéuticamente aceptables.

3. El plásmido de acuerdo con la reivindicación 1, para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria en un organismo humano, uso que comprende tomar linfocitos de los vasos periféricos de dicho organismo humano;

transfectar ex vivo dichos linfocitos con dicho plásmido; e inocular los linfocitos transfectados en dicho organismo humano.

4. El plásmido de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque dicho organismo humano está o estuvo afectado por tumores pertenecientes a la familia de carcinomas y/o adenomas y/o sarcomas y/o lipomas y/o tumores 15 sólidos y/o ascíticos, por carcinoma de próstata o pancreático, renal o pulmonar.

5. El plásmido de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque dicho organismo humano está o estuvo afectado por infecciones bacterianas, víricas, fúngicas y/o parasitarias.

6. El plásmido de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque dicho organismo humano está o estuvo afectado por la presencia de células tumorales que tienen en la superficie al menos un epítopo antigénico, cuya secuencia codificante está contenida en dicho plásmido.

Figura 2. Representación esquemática de un modelo de inserción de epítopos en las CDR del plásmido Figura 3. Estructura hipotetizada de una proteína con epítopos antigénicos que es codificada por el plásmido descrito.

Figura 1. Mapa del plásmido 1

1. 2483 pb Segmento que codifica la región variable vh62

2484-5077 pb Segmento que codifica la región constante γ1

6943-7737 pb Segmento que codifica el gen para resistencia a neomicina 10 9324-9267 pb origen de replicación de E. coli

Figura 4. Mapa de restricción del plásmido

Figura 5. Amplificación, por medio de ensayo de PCR del plásmido, de linfocitos transfectados ex vivo.