Péptidos moduladores de la activación de macrófagos, utilizables para el tratamiento de la artritis reumatoide.

Péptido citrulinado para usar como medicamento, estando caracterizado dicho péptido porque es capaz de disminuir la cantidad de TNF-a producida por macrófagos activados in vitro por inmunocomplejos entre AAPC y un antígeno citrulinado reconocido por dichos AAPC,

cuando se lleva a cabo un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, y porque se elige entre los siguientes péptidos:

a) un péptido definido por la secuencia X1PAPPPISGGGYX2AX3 (SEQ ID NO: 1) en la que X1 X2 representan cada uno un resto citrulilo o un resto arginilo, y X3 es un resto citrulilo, o un péptido de 5 a 25 aminoácidos, que comprende un fragmento de al menos 5 aminoácidos consecutivos de dicha secuencia que contiene dicho resto citrulilo X3;

b) un péptido definido por la secuencia GPX1VVEX2HQSACKDS (SEQ ID NO: 2) en la que X1 y X2 representan cada uno un resto citrulilo o un resto arginilo, y al menos uno de los restos X1 o X2 es un resto citrulilo, o un péptido de 5 a 25 aminoácidos, que comprende un fragmento de al menos 5 aminoácidos consecutivos de dicha secuencia que contiene dicho o dichos restos citrulilo.

Péptidos moduladores de la activación de macrófagos, utilizables para el tratamiento de la artritis reumatoide.

La presente invención se refiere a un modelo in vitro de activación de macrófagos, inducida por inmunocomplejos entre IgG específicas de la artritis reumatoide (en lo sucesivo abreviado “AR”) y sus dianas citrulinadas, y a su uso para identificar moléculas que tienen propiedades de modulación de la inflamación.

La artritis reumatoide es el más frecuente de los reumatismos inflamatorios crónicos. Se trata de una enfermedad autoinmunitaria, y el suero de los pacientes que la padecen contiene autoanticuerpos algunos de los cuales son específicos, y pueden constituir un marcador de esta enfermedad que permite su diagnóstico incluso en estados precoces. Por lo tanto, se han realizado investigaciones con vistas a identificar antígenos reconocidos por estos anticuerpos, con el fin de obtener preparaciones purificadas que se puedan usar en técnicas clásicas de diagnóstico inmunológico.

Se ha mostrado que autoanticuerpos (IgG) específicos de la AR reconocen diferentes variantes isoeléctricas de la (pro) filagrina (para una revisión, véase por ejemplo SERRE y VINCENT, en: Autoantibodies, PETER y SHOENFELD Eds, Elsevier Science Publishers, 271 – 276, 1996) . Por esta razón estos autoanticuerpos se han denominado: “autoanticuerpos dirigidos contra filagrina (AAF) ”. La solicitud EP 0511116 describe la purificación y caracterización de antígenos de la familia de las filagrinas reconocidos por estos anticuerpos, y su uso para el diagnóstico de la artritis reumatoide.

Posteriormente se han identificado los epítopos de la filagrina reconocidos por los AAF como regiones de la molécula de filagrina portadoras de restos citrulina, que resultan de la transformación de restos arginilo por una peptidilarginina desaminasa (Girbal-Neuhauser E. y col., J. Immunol., 162, 585 – 94, 1999; Schellekens G.A. y col.,

J. Clin. Invest., 101, 273 – 81, 1998) . El análisis de diferentes péptidos sintéticos derivados de la secuencia de la filagrina humana, ha mostrado que la desiminación (citrulinación) era necesaria para la constitución de los epítopos reconocidos por los AAF, que actualmente se llaman también autoanticuerpos dirigidos contra péptidos citrulinados (AAPC) .

Se han obtenido numerosos péptidos citrulinados reconocidos específicamente por los AAPC, y que se pueden usar para el diagnóstico de la AR, a partir de la filagrina (solicitud EP 0929669, solicitud EP 1475438) , así como de otras proteínas citrulinadas, entre las que se puede citar en particular la fibrina (Demande WO 01/02437) y la vimentina (Vossenaar ER y col., Arthritis Res. Ther. 2004; 6: R142 – R150) .

En paralelo, se ha mostrado que los AAPC son secretados por los plasmocitos del tejido sinovial (Masson-Bessière

C. y col., Clin. Exp. Immunol., 119, 544 – 52, 2000) y se dirigen específicamente contra las formas citrulinadas de las cadenas a y 1 de fibrina presentes en este tejido (Masson-Bessière C. y col., J. Immunol., 166, 4177 – 84, 2001; solicitud PCT WO 01/02437) .

Se ha sugerido que la formación de inmunocomplejos (en lo sucesivo abreviado “IC”) entre los AAPC y los epítopos citrulinados específicos de estos, presentes en el tejido sinovial, tendría una función en la patogénesis de la artritis reumatoide y en particular en el desencadenamiento y el mantenimiento de la reacción inflamatoria. Van Gaalen y col. (Journal of Immunology, 175, 5575, 2005) proponen un modelo para explicar la función de los AAPC in vivo en la AR, en el que los inmunocomplejos formados entre los AAPC y proteínas citrulinadas presentes en el tejido sinovial, activan el complemento. Esta activación del complemento provocaría la liberación de C5a (fragmento del complemento que se conoce como uno de los mediadores preponderantes en la inflamación) . Además, la ruta del complemento permitiría atraer y activar granulocitos, monocitos, macrófagos y mastocitos en el sitio de la inflamación.

Fournier (Joint Bone Spine, 72, 527, 2005) describe la función de los linfocitos T en el desarrollo de la AR. Describe que en el caso de la artrosis inducida por colágeno (CIA) , modelo de estudio experimental de la AR en ratones, las citoquinas proinflamatorias (en particular TNF-a eIL-11) son producidas por los macrófagos en presencia de linfocitos T activados que presentan un fenotipo Th1, y que la neutralización de estas citoquinas proinflamatorias es eficaz para reducir la gravedad de la CIA.

Los autores de la invención han puesto a punto un modelo in vitro de la activación de macrófagos inducida por la interacción entre los IC formados a partir de los AAPC y de sus epítopos citrulinados, y los macrófagos.

Este modelo que imita las condiciones fisiopatológicas del tejido sinovial reumatoide, lleva a cabo la evaluación de la activación de macrófagos, después de poner en contacto in vitro a estos con los IC formados por los AAPC y polipéptidos citrulinados reconocidos por dichos AAPC.

La activación de macrófagos, que estimula la producción de citoquinas proinflamatorias, se puede evaluar por la determinación de una o más de estas citoquinas (por ejemplo TNF-a, IL-11, IL-6, IL-8, GM-CSF, IL-15...) en los líquidos sobrenadantes de cultivo de macrófagos, después de poner en contacto a estos con dichos IC.

Este modelo está adaptado en particular a la evaluación de las propiedades de modulación de la inflamación de una molécula, y en particular de sus propiedades antiinflamatorias.

Se puede usar en particular para identificar in vitro agentes farmacológicos susceptibles de tener un efecto antagonista de la activación de los macrófagos por los IC, sea oponiéndose a la formación de los inmunocomplejos entre los AAPC y los antígenos citrulinados reconocidos por dichos AAPC, o sea oponiéndose a la unión de dichos complejos a los macrófagos.

La evaluación de las propiedades de modulación de la inflamación de una molécula que se va a ensayar, se puede realizar simplemente comprando la producción de una o varias citoquinas proinflamatorias en los líquidos sobrenadantes de cultivo de macrófagos activados por los IC como se ha descrito antes, en ausencia de la molécula que se va a ensayar, y en presencia de la misma.

La presente invención tiene como objeto un procedimiento de evaluación in vitro de las propiedades de modulación de la inflamación de una molécula, caracterizada porque comprende:

a) poner en presencia de autoanticuerpos dirigidos contra péptidos citrulinados (AAPC) un antígeno peptídico citrulinado reactivo con dichos AAPC, en condiciones que permitan la formación de inmunocomplejos entre dichos AAPC y dicho antígeno citrulinado;

b) poner en presencia de los inmunocomplejos formados en a) macrófagos, en condiciones que permitan la activación de dichos macrófagos por dichos inmunocomplejos, y determinar la cantidad de al menos una citoquina proinflamatoria producida por dichos macrófagos;

c) repetir la etapa a) y la etapa b) repitiéndose una y/o la otra de dichas etapas en presencia de la molécula a ensayar;

d) comparar la cantidad de citoquina o citoquinas proinflamatorias producidas en ausencia de la molécula a ensayar y en presencia de esta.

Ventajosamente, a la etapa a) le sigue una etapa de eliminación de las IgG que no están implicadas en la formación de inmunocomplejos con el antígeno citrulinado. Se trata, por ejemplo, de las IgG libres (que no han reaccionado con el antígeno citrulinado después de la etapa a) ) , o si procede, de las IgG probablemente implicadas en la formación de inmunocomplejos con la molécula a ensayar.

En este caso, el antígeno citrulinado se inmovilizará sobre un soporte sólido, tal como placas de microvaloración o perlas magnéticas, con el fin de permitir realizar fácilmente esta eliminación mediante lavado.

Los AAPC que se pueden usar para llevar a cabo el procedimiento de acuerdo con la invención son, por ejemplo, IgG obtenidas a partir de un suero, o ventajosamente de una mezcla de sueros de pacientes que padecen artritis reumatoide, y presentan una reacción positiva en uno o preferiblemente en varios ensayos de referencia de detección de AAPC (por ejemplo, el ensayo de inmunofluorescencia indirecta en criosecciones de esófago de rata,... [Seguir leyendo]

1. Péptido citrulinado para usar como medicamento, estando caracterizado dicho péptido porque es capaz de disminuir la cantidad de TNF-a producida por macrófagos activados in vitro por inmunocomplejos entre AAPC y un antígeno citrulinado reconocido por dichos AAPC, cuando se lleva a cabo un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, y porque se elige entre los siguientes péptidos:

a) un péptido definido por la secuencia X1PAPPPISGGGYX2AX3 (SEQ ID NO: 1) en la que X1 X2 representan cada uno un resto citrulilo o un resto arginilo, y X3 es un resto citrulilo, o un péptido de 5 a 25 aminoácidos, que comprende un fragmento de al menos 5 aminoácidos consecutivos de dicha secuencia que contiene dicho resto citrulilo X3;

b) un péptido definido por la secuencia GPX1VVEX2HQSACKDS (SEQ ID NO: 2) en la que X1 y X2 representan cada uno un resto citrulilo o un resto arginilo, y al menos uno de los restos X1 o X2 es un resto citrulilo, o un péptido de 5 a 25 aminoácidos, que comprende un fragmento de al menos 5 aminoácidos consecutivos de dicha secuencia que contiene dicho o dichos restos citrulilo.

2. Péptido citrulinado para usar como medicamento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque se elige del grupo constituido por:

- un péptido definido por la SEQ ID NO: 1 en la que X1 y X2 son restos arginilo y X3 es un resto citrulilo, o un péptido de 5 a 25 aminoácidos que comprende un fragmento de al menos 5 aminoácidos consecutivos de dicha secuencia que contiene dicho resto citrulilo;

- un péptido definido por la SEQ ID NO: 1 en la que X1 es un resto arginilo y X2 y X3 son restos citrulilo, o un péptido de 5 a 25 aminoácidos que comprende un fragmento de al menos 5 aminoácidos consecutivos de dicha secuencia que contiene dichos restos citrulilo;

- un péptido definido por la SEQ ID NO: 1 en la que X2 es un resto arginilo y X1 y X3 son restos citrulilo, o un péptido de 16 a 25 aminoácidos que comprende dichos restos citrulilo;

- un péptido definido por la SEQ ID NO: 1 en la que X1, X2 y X3 son restos citrulilo, o un péptido de 16 a 25 aminoácidos que comprende dichos restos citrulilo;

- un péptido definido por la SEQ ID NO: 2 en la que X1 es un resto arginilo y X2 es un resto citrulilo, o un péptido de 5 a 25 aminoácidos que comprende un fragmento de al menos 5 aminoácidos consecutivos de dicha secuencia que contiene dicho resto citrulilo;

- un péptido definido por la SEQ ID NO: 2 en la que X1 es un resto citrulilo y X2 es un resto arginilo, o un péptido de 5 a 25 aminoácidos que comprende un fragmento de al menos 5 aminoácidos consecutivos de dicha secuencia que contiene dicho resto citrulilo;

- un péptido definido por la SEQ ID NO: 2 en la que X1 y X2 son restos citrulilo, o un péptido de 5 a 25 aminoácidos que comprende un fragmento de al menos 5 aminoácidos consecutivos de dicha secuencia que contiene dichos restos citrulilo.

3. Péptido citrulinado para usar como medicamento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la función carboxilo terminal (COOH) de dicho péptido es sustituida por una función carboxamida (CONH2) .

4. Péptido citrulinado para usar como medicamento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque está dirigido al tratamiento de una enfermedad inflamatoria.

5. Péptido citrulinado para usar como medicamento de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque dicha enfermedad inflamatoria es la artritis reumatoide.

6. Procedimiento de evaluación in vitro, de las propiedades de modulación de la inflamación de una molécula, caracterizado porque comprende:

a) poner en presencia de autoanticuerpos dirigidos contra péptidos citrulinados (AAPC) un antígeno peptídico citrulinado reactivo con dichos AAPC, en condiciones que permitan la formación de inmunocomplejos entre dichos AAPC y dicho antígeno citrulinado;

b) poner en presencia de los inmunocomplejos formados en a) macrófagos, en condiciones que permitan la activación de dichos macrófagos por dichos inmunocomplejos, y determinar la cantidad de al menos una citoquina proinflamatoria producida por dichos macrófagos;

c) repetir la etapa a) y la etapa b) repitiéndose una y/o la otra de dichas etapas en presencia de la molécula a ensayar;

d) comparar la cantidad de citoquina o citoquinas proinflamatorias producidas en ausencia de la molécula a ensayar y en presencia de esta.

7. Procedimiento de selección de moléculas moduladoras de la inflamación, caracterizado porque comprende:

- llevar a cabo, con cada una de las moléculas a ensayar, un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6;

- seleccionar las moléculas capaces de modificar la cantidad de citoquina o de citoquinas proinflamatorias producidas por los macrófagos.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque se trata de un procedimiento de selección de moléculas antiinflamatorias, y porque comprende seleccionar moléculas capaces de disminuir la cantidad de citoquina o de citoquinas proinflamatorias producidas por los macrófagos.

9. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque dicho antígeno peptídico citrulinado se selecciona del grupo que comprende fibrinógeno citrulinado, filagrina citrulinada, vimentina citrulinada, fragmentos citrulinados de los mismos, y sus mezclas.

10. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado porque la citoquina proinflamatoria cuantificada en dicho procedimiento es el TNF-a.