Aislamiento de proteínas de plasma o suero.

Un proceso para el aislamiento a gran escala de proteínas a partir de una solución de proteína en donde la solución de proteína se obtiene a partir de sangre humana,

tales como suero humano y/o plasma humano, en cuyo proceso la albúmina e IgG se separan uno del otro, comprendiendo dicho proceso la etapas de:

a) ajustar opcionalmente el pH de la solución de proteína a un pH preestablecido;

b) ajustar opcionalmente la fuerza iónica o conductividad de la solución de proteína a una fuerza iónica preestablecida o conductividad iónica preestablecida;

c) aplicar dicha mezcla a una columna de adsorción que comprende un adsorbente, dicho adsorbente comprende una partícula con al menos un núcleo no poroso de alta densidad rodeado por un material poroso, el adsorbente comprende una densidad de partículas de al menos 1.5 g/ml y un diámetro medio de partículas en volumen de a lo sumo 150 μm;

d) lavar una o más de las proteínas a ser aislados a través del adsorbente, sin que una o más proteínas se enlazaran específicamente al adsorbente, para obtener una fracción de material no-enlazado;

e) someter el adsorbente a un tampón de elución para eluir al menos una de las proteínas específicamente enlazada al adsorbente;

en donde ya sea:

la albúmina e IgG se obtienen a partir del adsorbente por elución gradual; o

la albúmina se obtiene como el material no-enlazado a partir del adsorbente y posteriormente la IgG se obtiene a partir del adsorbente por elución gradual.

Aislamiento de proteínas de plasma o suero

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al fraccionamiento y aislamiento a gran escala de proteína (s) , tal como proteína (s) de plasma o suero humano, a partir de una solución de proteína. En particular, la presente invención se refiere una fabricación a gran escala de proteínas terapéutica (s) de plasma o suero a partir de fuentes tales como sangre, plasma, suero u otras fuentes derivadas de sangre usando un adsorbente acoplado con un ligando para la captura de la (s) proteína (s) , a partir de la solución de proteína.

Antecedentes técnicos y técnica anterior

La sangre humana y animal de comprende muchas proteínas y enzimas, que poseen propiedades de terapéuticas y potencialmente para salvar vidas. Algunas de estas proteínas se pueden encontrar en las células rojas de la sangre, mientras que otras se encuentran en solución en el plasma o suero. Desde mediados del siglo 20 tales proteínas han sido el objetivo del aislamiento a gran escala y específico con el propósito de purificar y estandarizar las proteínas para el uso como agentes terapéuticos humanos. Ejemplos de proteínas de la sangre notables que están actualmente disponibles como productos terapéuticos aislados son: albúmina, inmunoglobulina G, Factor VIII e inhibidor de la alfa-1-proteinasa. Algunas de estas proteínas se producen en la escala de varios miles de kilogramos por año (albúmina e IgG) , mientras que otras se producen sólo en gramo a kilogramo por escala al año. Sin embargo, a nivel mundial se procesan muchos millones de litros de sangre al año con el propósito de aislar estas proteínas.

La sangre, plasma sanguíneo y suero sanguíneo son proteínas extremadamente complicadas que contienen soluciones que comprenden muchos otros tipos de compuestos distintos de la proteína (s) o enzima (s) de interés, todo cuidadosamente equilibrado y regulado para trabajar en el torrente sanguíneo en un muy amplio intervalo de funciones bioquímicas complicadas tales como transporte de oxígeno, la defensa inmunológica y el sistema de coagulación que previene el sangrado excesivo a partir de las heridas. Especialmente cuando se extrae la sangre de un animal y expone a la atmósfera y la superficie de diferentes tipos de envases se vuelve muy inestable Aunque los agentes químicos, tales como heparina y citrato de sodio, se pueden añadir para aumentar la estabilidad y para un cierto grado prevenir la coagulación del plasma sanguíneo obtenido por la separación de las células de la sangre, el plasma será todavía muy frágil, altamente concentrado y la solución de proteína viscosa comprendiendo además cantidades significativas de lípidos. A pesar de la adición de estabilizadores cualquier manipulación o alteración de la composición de plasma implica el riesgo de desestabilización accidental, que puede causar la activación de la cascada de la coagulación, precipitación de por ejemplo componentes lipídicos así como la desnaturalización de la proteína (s) objetivo y de ese modo hace la sangre muy difícil de trabajar. Así, cualquier método empleado para aislar las proteínas a partir de la sangre o soluciones derivadas de sangre debe tomar en consideración la inestabilidad inherente de la solución y las propias proteínas. Esto ha demostrado ser un reto muy importante para la producción a gran escala de productos terapéuticos a partir de sangre.

Además, desde un punto de vista tecnológico la complejidad e inestabilidad de la sangre hace la separación y aislamiento de las proteínas de la sangre mucho más complicado y económicamente exigente que el aislamiento de proteínas a partir de otros tipos de solución de proteína tales como sobrenadantes de cultivo de células de mamíferos y caldo de fermentación a partir de microorganismos modificados genéticamente como se usa típicamente en la industria de la biotecnología. Además, la industria de la biotecnología sólo aislará típicamente un producto específico a partir de un sobrenadante de cultivo celular, mientras que por razones económicas y éticas la industria terapéutica del fraccionamiento de la sangre generalmente debe aislar la mayor cantidad de productos como sea posible a partir de la cantidad limitada de sangre disponible.

El costo de la sangre, suero y plasma ha aumentado muy significativamente durante las últimas décadas siendo la principal razón debido al aumento del costo de las medidas de seguridad necesarias para prevenir propagar las enfermedades virales de los donantes de sangre a los destinatarios de los productos de la sangre. Por más de 10-20 años el costo muy alto del plasma sanguíneo, así como el aumento de los costos para implementar las etapas de eliminación viral y otras medidas de seguridad durante el proceso ha puesto a la industria de fraccionamiento de sangre bajo una presión significativa para aumentar el rendimiento por litro de los productos individuales tales como inmunoglobulina G (IgG) e inhibidor de la alfa-1proteinasa.

Además, generalmente existe una fuerte necesidad de ampliar el número de productos que se pueden producir a partir de la misma cantidad de plasma es decir, producir un mayor número de diferentes proteínas a partir del plasma, sin dejar de ser

capaz de producir los productos existentes en rendimientos aceptables. La industria del fraccionamiento de la sangre ha experimentado que estas necesidades largamente sentidas son difíciles de satisfacer con la tecnología conocida y, aunque se han hecho intentos durante mucho tiempo para emplear técnicas de adsorción modernas como una alternativa a los métodos de precipitación establecidos existen todavía problemas importantes en términos de factibilidad económica y robustez del procesamiento de los métodos de adsorción hasta ahora descritos.

Uno de los métodos usados convencionalmente para el fraccionamiento de proteína (s) de plasma sanguíneo o del suero sanguíneo se ha descrito en US 2, 390, 074 (Cohn y otros) que describe un método para la fraccionamiento de proteínas de plasma o suero en gran escala que utilizan la precipitación con etanol y regula la temperatura, pH, fuerza iónica y tiempo para controlar la precipitación de ciertas proteínas de plasma humano. El método de fraccionamiento implica la adición gradualmente de etanol a la materia prima de plasma para obtener varios precipitados (fracciones) y los sobrenadantes correspondientes que comprenden diferentes soluciones de proteínas enriquecidas.

Un inconveniente del método de precipitación con etanol descrito por Cohn y otros es que algunas proteínas tienden a desnaturalizar durante el proceso lo que resulta en la disminución del rendimiento de la proteína que se aísla y la contaminación con agregados que necesitan que se eliminen antes de que se pueda obtener un producto terapéutico aceptable. Además, durante este método de fraccionamiento las proteínas precipitadas se tienen que resolubilizar para su procesamiento adicional. Tales soluciones de proteínas resolubilizadas pueden comprender niveles significativos de proteína insoluble (desnaturalizada) y material lipídico que lo hace difícil y que requiere mucho tiempo para elaborar el producto objetivo, lo que contribuye además significativamente a la pérdida de producto valioso. Además, es característico de este proceso que una proteína específica se pueda distribuir en varias de las fracciones obtenidas durante la adición gradualmente de etanol, que a su vez resulta en rendimientos bajos y elaboración que requiere mucho tiempo de las fracciones de proteínas re-combinadas.

En el fraccionamiento de por ejemplo el inhibidor de la alfa-1-proteinasa o inmunoglobulinas, tal como IgG, usando el método de fraccionamiento descrito por Cohn y otros el rendimiento del inhibidor de la alfa-1-proteinasa es tan bajo como 10-20 % y el rendimiento de IgG es tan bajo como 40-50 %. Sin embargo, ya que estos productos son muy necesarios y como existe un desabastecimiento del producto para satisfacer las necesidades de los pacientes, nuevos métodos para aislar tales productos son muy necesarios donde se reduce la pérdida de producto.

Durante la última década se han hecho muchos intentos para desarrollar un proceso de fraccionamiento que pueda proporcionar un aumento del rendimiento usando una variedad de otras técnicas, incluyendo la cromatografía. Sin embargo, los inconvenientes asociados con las técnicas de adsorción conocidas tales como regímenes de flujo bajo y capacidades de unión bajo lo que resultan en una baja productividad así como falta de robustez y dificultades en la aplicación de procedimientos de limpieza seguros han hecho difícil equilibrar el rendimiento y economía implicada en el fraccionamiento de proteínas... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para el aislamiento a gran escala de proteínas a partir de una solución de proteína en donde la solución de proteína se obtiene a partir de sangre humana, tales como suero humano y/o plasma humano, en cuyo proceso la albúmina e IgG se separan uno del otro, comprendiendo dicho proceso la etapas de:

a) ajustar opcionalmente el pH de la solución de proteína a un pH preestablecido; b) ajustar opcionalmente la fuerza iónica o conductividad de la solución de proteína a una fuerza iónica preestablecida o conductividad iónica preestablecida; c) aplicar dicha mezcla a una columna de adsorción que comprende un adsorbente, dicho adsorbente comprende una partícula con al menos un núcleo no poroso de alta densidad rodeado por un material poroso, el adsorbente comprende una densidad de partículas de al menos 1.5 g/ml y un diámetro medio de partículas en volumen de a lo sumo 150 µm; d) lavar una o más de las proteínas a ser aislados a través del adsorbente, sin que una o más proteínas se enlazaran específicamente al adsorbente, para obtener una fracción de material no-enlazado; e) someter el adsorbente a un tampón de elución para eluir al menos una de las proteínas específicamente enlazada al adsorbente;

en donde ya sea:

la albúmina e IgG se obtienen a partir del adsorbente por elución gradual; o la albúmina se obtiene como el material no-enlazado a partir del adsorbente y posteriormente la IgG se obtiene a partir del adsorbente por elución gradual.

2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, el cual es un proceso de adsorción en lecho expandido.

3. Un proceso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde, después de la etapa (e) , el adsorbente se somete a al menos un tampón de elución adicional para eluir al menos una proteína adicional específicamente enlazada al adsorbente.

4. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la solución de proteína no se suplementó con un alcohol.

5. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la solución de proteína se somete a al menos un tratamiento de eliminación de virus.

6. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde al menos un tratamiento de eliminación de virus se realiza antes de contactar la solución de proteína con el adsorbente.

7. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-6, en donde el tratamiento de eliminación de virus implica la adición de detergente y/o un disolvente orgánico, tales como Tween, Tritón, tri-n-butilfosfato, en la solución de proteína.

8. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde en el proceso el adsorbente comprende un polímero de matriz funcional que porta una pluralidad de grupos funcionales unidos covalentemente que comprenden un sistema de anillo aromático o heteroaromático y/o uno o más grupos ácidos.

9. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el grupo funcional se selecciona del grupo que consiste de ácido 2-mercaptobenzoico, ácido 2-mercaptonicotínico, ácido 2-aminobenzoico, ácido 3-aminobenzoico, y ácido 4aminobenzoico, ácido 4-hidroxifenil-mercapto-acético, ácido 4-hidroxifenil-mercapto-propiónico, ácido 4-hidroxifenilmercapto-butanoico, ácido 2, 3-dihidroxi-benzoico, ácido 2, 4 dihidroxi-benzoico, ácido 2, 5 di-hidroxi-benzoico, ácido 2, 6 dihidroxi-benzoico, ácido 3, 4-dihidroxi-benzoico, ácido 3, 5-dihidroxi-benzoico, ácido mercaptobencimidazol sulfónico, ácido ortanílico, ácido metanílico, ácido sulfanílico, ácido 4-metilanilina-2-sulfónico, ácido 4-metoxianilina-2sulfónico, ácido anilina-2, 5-disulfónico, ácido N-metilmetanílico, ácido 7-amino-1-naftol-3-sulfónico, ácido 1-naftol-4sulfónico, ácido 2-naftol-6-sulfónico y ácido 2-hidroxi-3-naftoico, y ácido 2-mercaptobenzimidazol-sulfónico, ácido 3, 4diaminobenzoico, y ácido 2- (4-aminofeniltio) acético.

10. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde otras proteínas sangre humana son seleccionadas del grupo que consiste de IgA, IgM, IgD, IgE, inhibidor de la alfa-1-proteinasa, proteína pro-coagulación de la sangre, proteína anti-coagulación de la sangre, agente trombolítico, proteína anti-angiogénica, a-2-antiplasmina, inhibidor de la esterasa C-1, apolipoproteína, HDL, LDL, Fibronectina, beta-2-glicoproteína I, fibrinógeno, plasminógeno, plasmina, activador de plasminógeno, inhibidor del plasminógeno, inhibidor de la proteasa plasmática, anti-trombina III, estreptoquinasa, inhibidor de inter-alfa-tripsina, a-2-macroglobulina, proteína amiloide, ferritina, pre-albúmina, GC-globulina, haemopexina, complemento-C3, transferrina, uroquinasa, a-1-ácidoglicoproteína, y los factores de coagulación o anti-coagulación tales como Factor II, Factor V, Factor VII, Factor VIII, factor von Willebrand, complejo Factor VIII -factor von Willebrand, Factor IX, Factor X, Factor XI, inhibidor C 1, proteína C y/o proteína S.

11. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde al menos dos fracciones de proteínas son proporcionados por el proceso.

12. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde cada uno de las fracciones de proteínas obtenidas en el proceso tienen una cantidad de contaminación cruzada de proteínas de menos del 20%.

13. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde al menos 2, tal como 3, por ejemplo 4, tal como 5, por ejemplo 6 de las proteínas seleccionadas del grupo que consiste de IgA, IgM, IgD, IgE, inhibidor de la alfa-1-proteinasa, proteína pro-coagulación de la sangre , proteína anti-coagulación de la sangre, agente trombolítico, proteína anti-angiogénica, a-2-antiplasmina, inhibidor de la esterasa C-1, apolipoproteína, HDL, LDL, Fibronectina, bet-2-glicoproteína I, fibrinógeno, plasminógeno, plasmina, activador de plasminógeno, inhibidor del plasminógeno, inhibidor de la proteasa plasmática, anti-trombina III, estreptoquinasa, inhibidor de inter-alfatripsina, a-2-macroglobulina, proteína amiloide, ferritina, pre-albúmina, GC-globulina, haemopexina, complemento-C3, transferrina, uroquinasa, a-1-ácido-glicoproteína, y los factores de coagulación o anti-coagulación tales como Factor II, Factor V, Factor VII, Factor VIII, factor von Willebrand, complejo Factor VIII - factor von Willebrand, Factor IX, Factor X, Factor XI, inhibidor de C1, proteína C y/o proteína S se separan simultáneamente uno de otro en al menos 2, tal como 3, por ejemplo 4, tal como 5, por ejemplo 6 fracciones individuales de proteína.

14. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde al menos 2, tal como 3, por ejemplo 4, tal como 5, por ejemplo 6 de las proteínas seleccionadas del inhibidor de la a-1-proteinasa, transferrina, trombina, Factor II, Factor V, Factor VII, Factor VIII, Factor IX, proteína C, Proteína S, a-1-ácido-glicoproteína y fibrinógeno se separan una de la otra simultáneamente en al menos 2, tal como 3, por ejemplo 4, tal como 5, por ejemplo 6 fracciones de proteínas individuales.

15. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el fibrinógeno se enlaza al adsorbente y simultáneamente uno o más de los factores de la coagulación o anti-aoagulación tales como el Factor II, Factor V, Factor VII, Factor VIII, Factor de von Willebrand, complejo del Factor VIII -factor de von Willebrand, Factor IX, Factor X, Factor XI, inhibidor C1, proteína C y/o Proteína S se obtienen como material no enlazado all adsorbente.

16. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la albúmina e IgG se enlazan al adsorbente y se obtiene simultáneamente el inhibidor-1-a-proteinasa como material no enlazado a partir del adsorbente.

17. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el fibrinógeno e IgG se unen al adsorbente y simultáneamente se obtiene la albúmina como material no enlazado a partir del adsorbente.

18. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el fibrinógeno e IgG se obtienen un partir del adsorbente mediante la elución gradual.

19. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el fibrinógeno, albúmina e IgG se enlazan al adsorbente y simultáneamente se obtiene el inhibidor-1-a-proteinasa como material no enlazado a partir del adsorbente.

20. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 19, en donde el fibrinógeno, albúmina e IgG se obtienen un partir del adsorbente mediante elución gradual.

21. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde al menos 1, tal como al menos 2, por ejemplo 3 de fibrinógeno, albúmina e IgG se enlaza/enlazan al adsorbente y simultáneamente la a-1-ácidoglicoproteína se obtiene como material no enlazado al adsorbente.

22. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde al menos 1, tal como al menos 2 por ejemplo 3 de fibrinógeno, albúmina e IgG se enlaza/enlazan al adsorbente y simultáneamente la a-1-ácidoglicoproteína y/o el inhibidor de la a- 1-proteinasa se obtiene/obtienen como material no enlazado al adsorbente.

23. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde la fracción de material no enlazado comprende la albúmina.

24. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1-10, en donde uno o más factores de la coagulación o factores de la anti-coagulación seleccionados del grupo que consiste de Factor II, Factor V, Factor VII, Factor VIII, Factor de von Willebrand, complejo del Factor VIII -factor de von Willebrand, Factor IX, Factor X, Factor XI, inhibidor de C1, proteína C y Proteína S se enlaza al adsorbente en una primera iteración del proceso.

25. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 24, en donde al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste de albúmina, IgG, transferrina y fibrinógeno se enlaza al adsorbente en una segunda iteración del proceso.

26. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 25, en donde al menos un inhibidor de la proteína seleccionada a partir del inhibidor de la a-1-proteinasa o a-1-ácido glicoproteína se enlaza al adsorbente en una tercera iteración del proceso.

27. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 24 en donde se eluyen uno o más factores de la coagulación o factores de la anti-coagulación a partir del adsorbente individualmente en etapas de elución separadas.