Un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos carboxiterminal de SEQ ID NO 1,

en que el péptido aumenta la producción de bacteriocinas cuando se añade a un cultivo de células productoras de bacteriocinas.

Péptidos inductores de bacteriocinas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención [0001] Esta invención se refiere a nuevos péptidos que estimulan la producción de bacteriocinas por las bacterias productoras en presencia de bacterias inductoras y a procedimientos para el uso de los péptidos para la producción de bacteriocinas.

Descripción de la técnica relacionada [0002] Las bacterias intestinales normales son críticas para la salud de cualquier animal hospedador. El hospedador se beneficia a través de los procesos metabólicos digestivos mediados por la biota bacteriana nativa. Desde la perspectiva de las bacterias intestinales, la competencia y la consiguiente evolución proporcionan nutrientes y espacio vital y aumentan el potencial reproductivo, lo que permite que ciertas cepas y especies obtengan ventajas de supervivencia. Durante la evolución bacteriana ha tenido lugar la producción de las bacteriocinas. Las bacteriocinas son antagonistas para otros organismos dentro de un nicho competitivo dado y, por lo tanto, proporcionan una ventaja ecológica. Típicamente, estas bacteriocinas son polipéptidos de bajo peso molecular y se clasifican sobre la base de diferencias en el peso molecular (Klaenhammer, FEMS Microbiol. Rev., volumen 12, 39-85, 1993) . Estos compuestos pueden digerirse fácilmente para dar sus aminoácidos componentes mediante enzimas proteasas del hospedador. Las bacteriocinas pueden representar un componente significativo de los beneficios derivados de la exclusión competitiva (Nurmi y Rantala, Nature, London, volumen 241, 210-211, 1973) .

Nurmi y Rantala (1973, cita anterior) describieron originalmente las ventajas de la exclusión competitiva en el control de la colonización por Salmonella entre pollos recién eclosionados mediante el uso de una flora bacteriana indefinida derivada de las heces de aves adultas sanas. Esta estrategia es una alternativa atractiva a las prácticas actuales en la cría de animales que implican el uso de antibióticos sintéticos. Se ha descrito una flora de exclusión competitiva derivada de mucosas (Stern y col., patente de los EE. UU. 5.451.400, concedida en septiembre de 1995) como un cultivo anaerobio derivado de raspaduras del revestimiento mucoso intestinal en gallinas adultas sanas. Esta flora indefinida proporcionó una excelente protección contra la colonización por Salmonella en pollos, pero solo proporcionó un control inconsistente de la colonización por Campylobacter (Stern, Poult. Sci. volumen 73, 402 - 407, 1994) . La exclusión competitiva tiene lugar dentro del tracto intestinal de las aves salvajes y contribuye a una sana ecología intestinal.

Los microorganismos producen una diversidad de compuestos que demuestran propiedades antibacterianas. Un grupo de estos compuestos, las bacteriocinas, constan de proteínas bactericidas con un mecanismo de acción similar al de los antibióticos ionóforos. Las bacteriocinas son frecuentemente activas contra especies que están estrechamente relacionadas con el productor de la bacteriocina. Su presencia generalizada en especies bacterianas aisladas de comunidades microbianas complejas, como el tracto intestinal, las superficies orales u otras superficies epiteliales, sugiere que las bacteriocinas pueden tener un papel regulador con respecto a la dinámica poblacional dentro de los ecosistemas bacterianos. Las bacteriocinas se definen como compuestos producidos por bacterias que tienen una fracción de proteína biológicamente activa y actividad bactericida (Tagg y col., Bacteriological Reviews, volumen 40, 722 - 256, 1976) . Otras características pueden incluir: (1) un limitado espectro de actividad inhibitoria centrado en especies estrechamente relacionadas; (2) la unión a receptores celulares específicos; (3) determinantes genéticos contenidos en plásmidos para la producción de bacteriocinas y para inmunidad de la célula hospedadora a las bacteriocinas. Otras sustancias antagonistas definidas de forma incompleta se han denominado "sustancias similares a bacteriocinas". Algunas bacteriocinas eficaces contra bacterias grampositivas, a diferencia de las bacterias gramnegativas, tienen un espectro de actividad más amplio. Se ha sugerido que el término bacteriocina, cuando se usa para describir agentes inhibitorios producidos por bacterias grampositivas, debería satisfacer unos criterios mínimos (1) ser un péptido y (2) tener actividad bactericida (Tagg y col., cita anterior) .

Con el fin de hacer económicamente factible el uso comercial de las bacteriocinas, es necesaria la optimización del rendimiento durante la producción (Chen y Hoover, Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, volumen 2, 82 - 100, 2003) . Chen y Hoover afirman que, para la producción de nisina, se encontró que los factores decisivos en el medio de crecimiento eran el mantenimiento de un pH óptimo y el enriquecimiento del medio con nutrientes específicos para cada cepa o cepas productoras de la bacteriocina.

Knutsen y col. (Journal of Bacteriology, volumen 186 (10) , 3078 - 3085, 2004) desvelan un péptido inductor de bacteriocinas (BIP) de 27 aminoácidos que induce la producción de bacteriocinas en Streptococcus pneumoniae. Diep y col. (Molecular Biology, volumen 47 (2) , 483 - 494, 2003) desvelan que se ha encontrado que una serie de bacterias grampositivas aplican una, así denominada, ruta de transducción de señales a base de feromonas peptídicas para regular la producción de péptidos antimicrobianos, conocidos como bacteriocinas, de numerosas bacterias del ácido láctico. También desvelan una feromona peptídica, PlnA, que induce la producción de bacteriocinas. Van Belkum y Stiles (Nat. Prod. Rep., volumen 17, 323 - 335, 2000) desvelan que algunas bacteriocinas requieren los productos de genes reguladores para su producción. Estos autores afirman que estos genes codifican un péptido inductor secretado y proteínas que son homólogas a histidina-cinasas y a reguladores de respuesta. La referencia desvela además que algunas bacteriocinas de la clase II son inducidas por un péptido inductor mientras que otras, como camobacteriocina B2 y sakacina P, son inducidas por un péptido inductor o se autoinducen por la bacteriocina sintetizada.

Mientras que se han encontrado diversos péptidos que inducen la producción de bacteriocinas en bacterias, en la técnica sigue existiendo la necesidad de una producción comercial de bacteriocinas mediante el uso de péptidos que aumenten el rendimiento de la producción de bacteriocinas in vitro. La presente invención proporciona péptidos que son diferentes de los péptidos de la técnica anterior y proporciona un procedimiento para la producción de grandes cantidades de bacteriocinas para uso comercial.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Un objetivo de la presente invención es proporcionar péptidos que estimulan la producción de bacteriocinas in vitro y tienen la secuencia carboxiterminal VKGLT (SEQ ID NO 1) .

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un péptido con la secuencia de aminoácidos: MVTKSLVLAWVVALLACGMVKGLT (SEQ ID NO 3) .

Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar un péptido con la secuencia de aminoácidos: TNVTKSWWVLAGCNQVVASNCNCGNVKGLT (SEQ ID NO 5) .

Aún otro objetivo de la presente invención es proporcionar un péptido con la secuencia de aminoácidos: WNKYKTNWVLSVCNTGCACAAVKGLT (SEQ ID NO 7) .

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento para aumentar la producción de bacteriocinas in vitro, en el que se añade un péptido con la secuencia carboxiterminal VKGLT (SEQ ID NO 1) a un cultivo de células productoras de bacteriocinas.

Aún otro objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento para aumentar la producción de la bacteriocina OR-7 in vitro, en el que se añade un péptido con la secuencia de SEQ ID NO 3 a un cultivo de células de Lactobacillus salivarius PDV-32 (NRRL B-30514) .

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento para aumentar la producción de la bacteriocina 50-52 in vitro, en el que se añade un péptido con la secuencia de SEQ ID NO 5 a un cultivo de células de Enterococcus faecium LWP-50-52 (NRRL B-30746) .

Aún otro objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento para aumentar la producción de la bacteriocina 760 in vitro, en el que se añade un péptido con la secuencia de SEQ ID NO 7 a un cultivo de células de Streptococcus cricetus LWP-760 (NRRL B-30745) .

DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS... [Seguir leyendo]

1. Un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos carboxiterminal de SEQ ID NO 1, en que el péptido aumenta la producción de bacteriocinas cuando se añade a un cultivo de células productoras de bacteriocinas.

2. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, en que el péptido es un péptido con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 3.

3. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, en que el péptido es un péptido con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 5.

4. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1. en que el péptido es un péptido con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 7.

5. Un procedimiento para aumentar la producción de una bacteriocina que comprende:

(a) la adición de una bacteria productora de la bacteriocina junto con una bacteria inductora a un sistema de cultivo,

(b) la adición de un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 y

(c) el cultivo de dicha bacteria junto con dicho péptido durante un tiempo para alcanzar una producción aumentada de dicha bacteriocina.

6. Un procedimiento para estimular la producción de una bacteriocina con la secuencia de SEQ ID NO 2 que comprende:

(a) la adición de la línea de células productoras de la bacteriocina NRRL B-30514 junto con la línea de células inductoras NRRL 30884 a un sistema de cultivo,

(b) la adición de un péptido con la secuencia de SEQ ID NO 3 y

(c) el cultivo de dicha bacteria junto con dicho péptido durante un tiempo para alcanzar una producción aumentada de dicha bacteriocina.

7. Un procedimiento para estimular la producción de una bacteriocina con la secuencia de SEQ ID NO 4 que comprende:

(a) la adición de la línea de células productoras de la bacteriocina NRRL B-30746 y la línea de células inductoras NRRL B-30510 a un sistema de cultivo,

(b) la adición de un péptido con la secuencia de SEQ ID NO 5 a dicho sistema y

(c) el cultivo de dichos bacteria y péptido durante un tiempo para alcanzar una producción aumentada de dicha bacteriocina.

8. Un procedimiento para estimular la producción de una bacteriocina con la secuencia de SEQ ID NO 6 que comprende:

(a) la adición de la línea de células productoras de la bacteriocina NRRL B-30745 junto con la línea de células inductoras NRRL B-30510 a un sistema de cultivo,

(b) la adición de un péptido con la secuencia de SEQ ID NO 7 y

(c) el cultivo de dicha bacteria junto con dicho péptido durante un tiempo para alcanzar una producción aumentada de dicha bacteriocina.

9. Un procedimiento para estimular la producción de una bacteriocina con la secuencia de SEQ ID NO 2 que comprende:

(a) la adición de la línea de células productoras de la bacteriocina NRRL B-30514 junto con la línea de células inductoras NRRL 30884 a un sistema de cultivo,

(b) la adición de un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 y

(c) el cultivo de dicha bacteria junto con dicho péptido durante un tiempo para alcanzar una producción aumentada de dicha bacteriocina.

10. Un procedimiento para estimular la producción de una bacteriocina con la secuencia de SEQ ID NO 4 que comprende:

(a) la adición de la línea de células productoras de la bacteriocina NRRL B-30746 y la línea de células inductoras NRRL B-30510 a un sistema de cultivo,

(b) la adición de un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 a dicho sistema y

(c) el cultivo de dichos bacteria y péptido durante un tiempo para alcanzar una producción aumentada de dicha

bacteriocina.

11. Un procedimiento para estimular la producción de una bacteriocina con la secuencia de SEQ ID NO 6

que comprende: 5

(a) la adición de la línea de células productoras de la bacteriocina NRRL B-30745 junto con la línea de células inductoras NRRL B-30510 a un sistema de cultivo,

(b) la adición de un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 y

(c) el cultivo de dicha bacteria junto con dicho péptido durante un tiempo para alcanzar una producción aumentada 10 de dicha bacteriocina.

12. La cepa aislada de Enterococcus faecium NRRL B-30746.

13. La cepa bacteriana aislada NRRL B-30745. 15

14. Una bacteriocina aislada producida por una cepa seleccionada del grupo que consta de NRRL B30746 y NRRL B-30745, en que la bacteriocina tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 4 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 6.