Péptido de síntesis no nativo ciclado y complejo de péptidos que comprende dicho péptido ciclado, destinado a inducir y a caracterizar la prevención o el tratamiento de afecciones en mamíferos.

Péptido de síntesis no nativo ciclado destinado a inducir una producción importante de anticuerpos específicos de isotipo IgG2 que permite distinguir en caso de afecciones asociadas a estado de hiperestimulación de tipo retardado,

un animal o ser humano infectado o enfermo, de un animal o ser humano no infectado o no enfermo pero vacunado o tratado, caracterizado por la siguiente secuencia de 5 aminoácidos (E34P) (SEQ ID N.o 1):

E-D-E-H-K-G-Y-C-R-L-G-N-D-C-R-T-T-E-P-T-T-T-A-T-P-R-G-T-P-T-P-A-P

estando dicha secuencia ciclada por puente disulfuro entre la cisteína en la posición 9 y la cisteína en la posición 15.

Péptido de síntesis no nativo ciclado y complejo de péptidos que comprende dicho péptido ciclado, destinado a inducir y a caracterizar la prevención o el tratamiento de afecciones en mamíferos La presente invención se refiere a un péptido de síntesis no nativo ciclado mediante puente disulfuro y a su mezcla con otros dos péptidos de síntesis no nativos así como a un adyuvante, para formar un complejo destinado a inducir y a caracterizar la prevención o el tratamiento de afecciones en mamíferos cuya inmunidad protectora depende de la estimulación de los linfocitos de tipo Th1 y concretamente de un estado de hiperestimulación de tipo retardado.

Este complejo es notable más particularmente porque permite inducir una producción importante de anticuerpos específicos de isotipo IgG2, que permite en caso de afecciones asociadas a estado de hiperestimulación de tipo retardado, distinguir un animal o ser humano infectado o enfermo, de un animal o ser humano no infectado o no enfermo pero vacunado o tratado.

Finalmente la presente invención puede usarse como reactivo que induce una estimulación de los linfocitos de tipo Th1 concretamente para la prevención o el tratamiento de afecciones asociadas a estado de hiperestimulación inmediata y como reactivos de diagnóstico in vitro que permiten detectar los anticuerpos marcadores de vacunación o de tratamiento, es decir las IgG2 específicas del péptido ciclado. Finalmente, la presente invención también se refiere al papel neutralizante de esos IgG2 caracterizado por la inhibición de la proliferación de las formas promastigotas o amastigotas de Leishmania.

Numerosas situaciones patológicas están asociadas a un estado inmunitario de tipo Th1 o Th2.

Por ejemplo, la exacerbación de la vía Th2 correspondiente a un estado de hiperestimulación inmediata induce determinadas afecciones tales como dermatitis atópicas caninas, las alergias y el asma. La obtención de una curación para esas afecciones se realiza mediante inmunoestimulantes que permiten el paso de un estado de tipo Th2 a un estado inmunitario de tipo Th1.

Por otra parte, este estado inmunitario Th1 está en plena correlación con un estado de resistencia a los patógenos intracelulares, tales como Leishmania, Tr y panosoma, Candida, Mycobacterium y Listeria.

Con respecto a la inmunopatología del asma, la bibliografía a lo largo de la última década ha designado al linfocito T específico del alérgeno como principal responsable de la reacción inmunoalérgica (Magnan. A et al. “Cytoknies, from atopy to athsma: the Th2 dogma revisited” Cell Mol Biol, 2001, 47, 679-687) . Entre los linfocitos T, la subpoblación Th2 productora de IL4 aparece en primer lugar y es necesaria para la inducción de esta reacción. Por tanto es natural que se establezcan estrategias para seleccionar como diana específicamente los linfocitos y en particular los Th2.

Este tipo de estrategia también puede seguirse para las leishmaniosis.

Las leishmaniosis constituyen un conjunto complejo de infecciones parasitarias que causan estragos en grandes regiones del mundo (88 países, distribuidos en 4 de los 5 continentes, se ven afectados) y que son responsables de una gran gama de manifestaciones clínicas (cutáneas, mucocutáneas y viscerales, siendo estas la forma más grave ya que es mortal en ausencia de tratamiento) .

350 millones de personas están expuestas al riesgo de contraerlas; aproximadamente 12 millones son portadores del parásito y se estima que la incidencia anual es de entre 2 y 2, 5 millones de nuevos casos, de los cuales 500.000 personas están afectadas por leishmaniosis visceral.

La leishmaniosis visceral (LV) está provocada por parásitos del complejo Leishmania donovani (L. infantum/chagasi y L. donovani) que son parásitos intracelulares exclusivos del macrófago. Al contrario que otras especies de Leishmania que provocan formas cutáneas de la enfermedad (L. major, L. brasiliensis...) , las Leishmania del complejo donovani presentan una capacidad de diseminarse al conjunto de los órganos profundos en los que se multiplican. Los pacientes afectados por LV presentan entonces un cuadro clínico que asocia una fiebre moderada pero persistente, una hepatoesplenomegalia y una pancitopenia que conduce generalmente a la muerte si no se inicia ningún tratamiento específico con suficiente rapidez.

Los cánidos salvajes y los perros son las principales reservas de L. chagasi en América Central y Sudamérica, y de L. infantum en la cuenca mediterránea, extendiéndose a determinadas regiones de Oriente Medio y Asia. En estas regiones forzosamente endémicas para la leishmaniosis canina, la incidencia de la enfermedad en el ser humano es muy baja.

Aunque la LV es un problema importante en el sur de Europa con la extensión de la pandemia del SIDA y la aparición de un número creciente de coinfecciones por Leishmania/VIH, está lejos de estar controlada y se vuelve muy preocupante como problema de salud pública. En otras partes del mundo concretamente en las zonas de endemia por L. donovani: se estima que es de aproximadamente 1/5 de la población en Sudán y en la India donde epidemias letales han causado cientos de miles de víctimas estas últimas décadas. Además la situación se vuelve crítica en la India con la aparición de cepas resistentes a los antimoniados pentavalentes (medicamentos de primera línea) .

El control de las leishmaniosis pasa necesariamente por la quimioterapia. Esta última se pone desgraciadamente en peligro por tratamientos largos, tóxicos y molestos acompañados de numerosos casos de recidiva y por la aparición de fenómenos de quimiorresistencia. Actualmente parece evidente que el control de esta endemia parasitaria dependerá del descubrimiento de nuevos medios de prevención y de tratamientos abordables para las poblaciones afectadas, siendo la vacunación el medio más adaptado.

El hecho de poder inducir una inmunidad adquirida a la reinfección en un individuo que se había infectado voluntariamente con parásitos vivos ha mostrado muy rápidamente que la vacunación contra estas parasitosis era posible, al menos para las formas cutáneas de leishmaniosis. Estas prácticas, también denominadas leishmanización, usadas durante mucho tiempo en Oriente Medio, Irán y la antigua URSS, se han abandonado posteriormente debido a su peligrosidad.

Entre los candidatos de vacunas propuestos durante estas últimas décadas, se distinguen cronológicamente las vacunas de primera generación que usan los promastigotes vivos, muertos o atenuados que en el ratón han proporcionado resultados más que mitigados. Después, más recientemente, la llegada de las técnicas de biología molecular ha permitido el desarrollo de vacunas con subunidades o constituidas por proteínas recombinantes, tales como GP63, GP46, lipofosfoglicano (LPG) , ..., principalmente recombinantes de proteínas principales expuestas en la superficie de los parásitos. Algunas de esas proteínas recombinantes han conferido un buen nivel de protección contra una infección experimental en el ratón. Finalmente, existen las vacunas de tercera generación que recurren a la genómica funcional y usan transgenes como microorganismos transfectados con el gen de la GP63 y Leishmania recombinantes de virulencia atenuada o vacunas de ADN.

Con respecto a estos trabajos se constatan tres puntos:

- la vacunación contra las leishmaniosis cutáneas ha sido objeto de numerosos estudios en comparación con los que se refieren a la leishmaniosis visceral. No obstante, los modelos de infección experimental para la leishmaniosis visceral son más difíciles de poner en práctica (concretamente a causa de la dificultad de infectar experimentalmente a los roedores) .

- se han obtenido resultados algunas veces extremadamente interesantes en el ratón. Pero es difícil y peligroso trasladar directamente resultados obtenidos en el ratón a modelos de infección natural de la leishmaniosis (perro, ser humano) . Los trabajos de Dunan et al. realizados en 1989 son un ejemplo muy demostrativo de ello. Estos autores obtuvieron una protección muy buena en el ratón contra una infección de prueba por L. infantum usando una fracción antigénica denominada LiF2. Esta misma fracción, inyectada en perros, no sólo no los protegía sino que, lo que es más grave, aumentaba su susceptibilidad a la infección

- pocos candidatos de vacuna han superado la fase experimental (ratones, hámsteres) debido a la dificultad de poner en práctica ensayos clínicos largos, costosos y dificultosos.

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1. Péptido de síntesis no nativo ciclado destinado a inducir una producción importante de anticuerpos específicos de isotipo IgG2 que permite distinguir en caso de afecciones asociadas a estado de hiperestimulación de tipo retardado, un animal o ser humano infectado o enfermo, de un animal o ser humano no infectado o no enfermo pero vacunado o tratado, caracterizado por la siguiente secuencia de aminoácidos (E34P) (SEQ ID N.o 1) :

E-D-E-H-K-G-Y-C-R-L-G-N-D-C-R-T-T-E-P-T-T-T-A-T-P-R-G-T-P-T-P-A-P

estando dicha secuencia ciclada por puente disulfuro entre la cisteína en la posición 9 y la cisteína en la posición 15.

2. Complejo de péptidos de síntesis no nativos destinado a inducir y a caracterizar la prevención y/o el tratamiento de afecciones en mamíferos cuya inmunidad protectora depende de la estimulación de los linfocitos de tipo Th1, y concretamente de un estado de hiperestimulación de tipo retardado, caracterizado porque contiene:

- la secuencia ciclada (E34P) según la reivindicación 1;

- y la siguiente secuencia (A16E) de 16 aminoácidos (SEQ ID N.o 2) o derivados (análogos estructurales) de la misma:

A-A-R-C-A-R-C-R-E-G-Y-S-L-T-D-E

en la que C puede sustituirse por S y L por I;

- y la siguiente secuencia (A16G) de 16 aminoácidos (SEQ ID N.o 3) o derivados (análogos estructurales) de la misma:

A-A-S-S-T-P-S-P-G-S-G-C-E-V-D-G

en la que C puede sustituirse por S y L por I;

- y un adyuvante que induce preferiblemente una respuesta de mediación celular.

3. Complejo de péptidos de síntesis según la reivindicación 2, caracterizado porque el adyuvante es QA21, saponina, quil-A o cualquier otro derivado de los mismos conocido por el experto en la técnica, tal como QS21.

4. Complejo de péptidos de síntesis según la reivindicación 2 ó 3, caracterizado porque las secuencias peptídicas E34P, A16E y A16G están unidas en una razón E34P/A16E/A16G: 10/25/25.

5. Uso del péptido E34P según la reivindicación 1 o del complejo según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 para la fabricación de un medicamento, o de una vacuna, o de un reactivo de diagnóstico in vitro e in vivo, para la inducción o el diagnóstico en un mamífero de anticuerpos específicos y más particularmente de isotipo IgG2, asociados con un estado inmunitario de tipo Th1.

6. Complejo de péptidos de síntesis según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque los péptidos E34P, A16E y A16G están unidos a portadores (moléculas grandes de tipo KLH, lipopéptidos de tipo palmitoílo o derivados) para hacer que sean inmunógenos.

7. Complejo según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 ó 6, acondicionado en una forma tal que puede administrarse mediante diferentes vías: subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, parenteral y oral.

8. Uso del péptido de síntesis no nativo ciclado E34P destinado a inducir inmunoglobulinas de clase IgG2 según la reivindicación 1 para neutralizar in vitro la proliferación de los amastigotes y promastigotes de Leishmania sp.

9. Producto de diagnóstico in vitro caracterizado porque contiene el péptido ciclado E34P según la reivindicación 1, o el complejo de péptidos según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 ó 6, para la detección de una respuesta humoral y particularmente IgG2, que permite concretamente la puesta en evidencia de un estado inmunitario de tipo Th1 y de un estado de hiperestimulación retardada, el seguimiento de la respuesta inmunitaria en mamíferos vacunados o no vacunados pero tratados, y el seguimiento de la eficacia de una vacunación o de un tratamiento quimioterápico y/o inmunoterápico.

10. Kit de diagnóstico in vitro que comprende el producto de diagnóstico según la reivindicación 9, caracterizado porque el péptido ciclado E34P o el complejo de péptidos está unido a un soporte sólido.

11. Kit de diagnóstico in vitro según la reivindicación 10, caracterizado porque el péptido ciclado E34P o el complejo de péptidos está unido a membranas de nitrocelulosa u otros polímeros, soportes de látex y materiales de plástico (polímero) .