Oligonucleótidos contra la infección de VIH y su uso en la prevención y tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia adquirida.

Un ARN, donde dicho ARN posee actividad contra la infección por el VIH y donde dicho ARN se selecciona delgrupo que consiste en:

a) un ARN bicatenario derivado por apareamiento de SEC ID Nº: 4 y la secuencia complementaria de ésta, SEC IDNº: 5 y la secuencia complementaria de ésta, o SEC ID Nº: 6 y la secuencia complementaria de ésta;

b) un ARN bicatenario derivado por apareamiento de un fragmento de SEC ID Nº: 4 y la secuencia complementariade éste, un fragmento de SEC ID Nº: 5 y la secuencia complementaria de éste o un fragmento de SEC ID Nº: 6 y lasecuencia complementaria de éste:

(1) uaugggguaccugugugga (SEC.ID Nº:4);

(2) gccaauucccauacauuauugugc (SEC.ID Nº:5);

(3) uuaaauggcagucuagcagaa (SEC.ID Nº:6);

donde dicho(s) fragmento (s) de SEC.ID Nº:4, SEC.ID Nº:5 o SEC.ID Nº:6 en b) se seleccionan del grupo queconsiste en

un fragmento de 18 nt de SEC. ID Nº: 4, SEC. ID Nº: 5 o SEC. ID Nº: 6;

un fragmento de 19 nt de SEC. ID Nº: 5 o SEC. ID Nº: 6;

un fragmento de 20 nt de SEC. ID Nº: 5 o SEC. ID Nº: 6;

un fragmento de 21 nt de SEC. ID Nº: 5;

un fragmento de 22 nt de SEC. ID Nº: 5;

un fragmento de 23 nt de SEC. ID Nº: 5.

Oligonucleótidos contra la infección de VIH y su uso en la prevención y tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia adquirida

Area técnica La invención se refiere a un conjunto de oligonucleótidos contra la infección por el VIH y a su aplicación en la prevención y el tratamiento del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) .

Antecedentes de la tecnología Los descubrimientos recientes demostraron que el ARN bicatenario corto actúa como ARN de interferencia en diversas células de mamíferos y que la expresión de genes puede ser silenciada específicamente. La expresión génica viral (incluido el VIH) puede ser silenciada por esta vía. Debido a la alta frecuencia de mutación del genoma del VIH, la mayor parte del ARN de interferencia puede silenciar la expresión de genes de cepas específicas y no se puede utilizar como un método universal en la genoterapia del SIDA.

Wee-Sung et al (Nucleic Acid Res., vol. 30, Nº 22, 2002, páginas 4830-4853) dan a conocer la inhibición a través de ARNi de la replicación y la expresión de genes del VIH-1 en células transinfectadas tratadas con ARNbc más largo correspondiente a regiones en gag y env. Esto se lleva a cabo sin optimización de la secuencia diana.

Capodici et al (J. Immunol., vol.169, 2002, páginas 5196-5201) dan a conocer la inhibición de la infección por el VIH1 mediante interferencia de ARN mediada por ARNip utilizando dos ARNip bicatenarios cortos diferentes, dirigidos al VIH-gag en la represión de la replicación viral. Esto se lleva a cabo sin optimización de la secuencia diana.

Novina et al (Nature Medicine, vol. 7, Nº 8, 2002, páginas 681-686) dan a conocer la inhibición de la infección por el VIH-1 y la replicación en células por ARNip bicatenarios dirigidos a gag - p24. Esto se lleva a cabo sin optimización de la secuencia diana.

WO 99/09154 da a conocer métodos de inhibición de la infección por el VIH-1 por ARN antisentido (monocatenario) . Los diversos ARN antisentido se derivan de los nucleótidos 324-345 del VIH-1, que abarca el codón de inicio ATG del gen gag.

Jacque J M et al.. (Nature, vol. 418, Nº 6896, 2002, páginas 435-438) dan a conocer la inhibición por ARNi de la replicación con diversas moléculas de ARNip bicatenario corto dirigidas contra 5'-LTR, vif y nef.

Yamamoto et al (Microbiol. and Immunol., vol. 46, Nº 11, 2002, páginas 809-817 (dan a conocer la inhibición de la replicación del VIH-1 con ARN bicatenario largo de nef.

Coburn et al (J. Virol., vol. 76, Nº 18, páginas 9225-9231) dan a conocer la inhibición por ARNi de la replicación del VIH con diversas moléculas de ARNip bicatenario corto dirigidas contra tat y rev.

Lee et al (Nature Biotechnology, vol. 20, 2002, páginas 500-505) dan a conocer la inhibición por ARNi de la replicación del VIH con diversas moléculas de ARNip bicatenario corto dirigidas contra rev.

WO 03/070193 da a conocer la inhibición por ARNip de la replicación del VIH y la infección por el VIH, y otras realizaciones utilizando ARNip específicos. Esto se lleva a cabo sin optimización de la secuencia diana.

Divulgación de la invención El propósito de la invención es proporcionar un conjunto de nucleótidos para la prevención de la infección por el VIH y el tratamiento del SIDA.

El otro propósito es proporcionar la aplicación de los oligonucleótidos mencionados antes.

Para esos fines, se emplearon los métodos siguientes.

Un conjunto de secuencias de ARN que se muestran de acá en adelante, o todos los fragmentos de las secuencias, que demuestren actividad contra la infección por el VIH y sean empleados en la prevención y el tratamiento del SIDA. Los nucleótidos incluyen ARN bicatenario y cualquier fragmento derivado de las secuencias derivadas por apareamiento de las secuencias con sus secuencias complementarias.

( 4 ) uaugggguaccugugugga ;

( 5 ) gccaauucccauacauuauugugc ; (6) uuaaauggcagucuagcagaa; En la invención se obtuvieron secuencias de oligonucleótidos conservadas entre todo el genoma del VIH publicado mediante alineamiento de homología. La expresión de genes del VIH pudo ser silenciada y el genoma del VIH se pudo degradar cuando el ARN se introdujo en células de mamíferos. Los productos farmacéuticos derivados de las secuencias conservadas pueden disminuir significativamente los problemas de resistencia a los fármacos que resultaron de la mutagénesis genómica.

Un conjunto de secuencias de ARN, que pueden ser modificadas por otro nucleótido en el extremo 5' o 3' terminal. Generalmente se agregaron UU en el extremo 3' del fragmento de ARN para asegurar la coincidencia entre el ARN y el ARNm deseado.

Un conjunto de secuencias de ARN en horquilla para el control de la infección por el VIH y para la prevención y el tratamiento del SIDA, las secuencias en horquilla se derivaron por hibridación de las secuencias (SEC. ID Nº 4 ~ SEC. ID Nº 6) , o los segmentos pertinentes en el extremo 5' terminal, con sus secuencias complementarias, en el cual las secuencias de ARN y las secuencias complementarias se unieron mediante una secuencia no complementaria. El ARN tipo horquilla mantiene la actividad de interferencia de ARN, y se emplea particularmente para expresar ARN interferente en la célula porque es un ARN molecular.

Un conjunto de secuencias de ADN o de sus fragmentos que actúan contra la infección por el VIH y se utilizan en la prevención y el tratamiento del SIDA: 1) las secuencias de ADN o sus fragmentos, que corresponden a las secuencias de ARN que se muestran antes o sus fragmentos (SEC. ID Nº 4 ~ SEC. ID Nº 6 en la tabla 1) como secuencia de ARN bicatenario formado por hibridación de los ARN que se muestran antes con su secuencia complementaria, o, 2) las secuencias de ADN o sus fragmentos, que corresponden a las secuencias de ARN descritas en 1) o a sus fragmentos que fueron modificados en sus extremos 5' o 3' añadiendo nucleótidos; o 3) una secuencia de ADN bicatenario, que corresponde a la secuencia de ARN tipo horquilla como el descrito antes.

Un conjunto de vectores de expresión, que incluyen tanto los vectores de ADN como los vectores de ARN contra la infección por el VIH y que se usan en la prevención o el tratamiento del SIDA, en el cual están contenidas las secuencias de ARN o ADN descritas antes. El ARN de interferencia se puede expresar cuando los vectores que contienen las secuencias de ADN y ARN mencionadas antes se introdujeron en las células bajo el control de elementos reguladores. Los vectores son vectores de ARN y vectores de ADN. Los vectores de ARN incluyen, pero no exclusivamente, vectores retrovirales, vectores de ADN que tienen las secuencias de ADN indicadas y los elementos de control incluyen vectores plasmídicos y virales como el virus asociado a adenovirus (AAV) .

Un conjunto de liposomas contra la infección por el VIH y para la prevención y el tratamiento del SIDA, en el cual se recubrieron las secuencias de ARN y ADN así como los vectores de expresión indicados antes contra la infección por el VIH y el tratamiento y la prevención del SIDA. El ARN interferente, o vectores que expresan el ARN interferente, fueron introducidos en la célula por el liposoma indicado antes.

El método para luchar contra la infección por el VIH y para la prevención y el tratamiento del SIDA, mediante el cual los ARN, los ADN, los vectores de expresión o los liposomas indicados antes, se introdujeron en líneas celulares eucariotas, animales o seres humanos. Por ejemplo, métodos que emplean liposomas y vectores virales.

La aplicación de los nucleótidos en la prevención de la infección por el VIH y el tratamiento del SIDA. Los productos farmacéuticos para el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de la infección por el VIH y el SIDA se derivaron de los ARN, los ADN, los vectores de expresión, los liposomas o los métodos mencionados antes.

Descripciones de las figuras adjuntas

Fig. 1. Construcción del plásmido reportero pEGFP-gp120. Fig. 2. La expresión de EGFP gp120 fue silenciada por ARN interferente bicatenario. Fig. 3. La expresión de EGFP gp120 fue silenciada por ARN interferente bicatenario como se demostró por

inmunotransferencia tipo Western. Fig. 4. La construcción de p-H1-gp120i a partir del cual se pudo expresar el ARN en horquilla en las células. Fig. 5. Construcción del plásmido pAAV-120i. Fig. 6. La expresión de GP120 GFP fue silenciada por el ARN bicatenario en horquilla expresado por el AAV

recombinante.

Mejores métodos para realizar la invención Todos los protocolos se basan en general en los protocolos descritos en Molecular Cloning, 3ª edición.

Ejemplo 1: Secuencia... [Seguir leyendo]

1. Un ARN, donde dicho ARN posee actividad contra la infección por el VIH y donde dicho ARN se selecciona del grupo que consiste en:

a) un ARN bicatenario derivado por apareamiento de SEC ID Nº: 4 y la secuencia complementaria de ésta, SEC ID Nº: 5 y la secuencia complementaria de ésta, o SEC ID Nº: 6 y la secuencia complementaria de ésta; b) un ARN bicatenario derivado por apareamiento de un fragmento de SEC ID Nº: 4 y la secuencia complementaria de éste, un fragmento de SEC ID Nº: 5 y la secuencia complementaria de éste o un fragmento de SEC ID Nº: 6 y la secuencia complementaria de éste:

(1) uaugggguaccugugugga (SEC.ID Nº:4) ;

(2) gccaauucccauacauuauugugc (SEC.ID Nº:5) ;

(3) uuaaauggcagucuagcagaa (SEC.ID Nº:6) ;

donde dicho (s) fragmento (s) de SEC.ID Nº:4, SEC.ID Nº:5 o SEC.ID Nº:6 en b) se seleccionan del grupo que consiste en un fragmento de 18 nt de SEC. ID Nº: 4, SEC. ID Nº: 5 o SEC. ID Nº: 6; un fragmento de 19 nt de SEC. ID Nº: 5 o SEC. ID Nº: 6; un fragmento de 20 nt de SEC. ID Nº: 5 o SEC. ID Nº: 6; un fragmento de 21 nt de SEC. ID Nº: 5; un fragmento de 22 nt de SEC. ID Nº: 5; un fragmento de 23 nt de SEC. ID Nº: 5.

2. El ARN de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho ARN se modifica en su extremo 5' o extremo 3' añadiendo dos nucleótidos uracilo.

3. El ARN de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho ARN es un ARN en horquilla que consta de una parte tallo y una parte bucle, y dicha parte tallo es una parte de ARN bicatenario de acuerdo con la reivindicación 1, derivado por apareamiento de SEC. ID Nº: 4 y la secuencia complementaria de ésta; SEC. ID Nº: 5 y la secuencia complementaria de ésta; SEC. ID Nº: 6 y la secuencia complementaria de ésta; un fragmento de secuencia SEC. ID Nº: 4 y la secuencia complementaria de éste; un fragmento de secuencia SEC. ID Nº: 5 y la secuencia complementaria de éste;

o un fragmento de secuencia SEC. ID Nº: 6 y la secuencia complementaria de éste; y dicha parte bucle es un espaciador no complementario.

4. Un ADN bicatenario que codifica el ARN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Un vector de expresión que contiene el ADN de acuerdo con la reivindicación 4.

6. El ARN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, un ADN de acuerdo con la reivindicación 4 o un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5, recubiertos por liposomas.

7. Una línea celular eucariota que contiene un ARN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o 6, un ADN de acuerdo con la reivindicación 4 o 6, o un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 o 6.

8. Un ARN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o 6, un ADN de acuerdo con la reivindicación 4 o 6, o un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, para usar en la prevención o el tratamiento de la infección por el VIH o la prevención o el tratamiento del sida.

9. El uso del ARN o el ADN descritos en cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o 6, o los vectores de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 o 6 en el diagnóstico del VIH y el sida.

Fig. 5