Oligonucleótido inmunoestimulador y aplicación farmacéutica del mismo.

Oligonucleótido inmunoestimulador que está constituido por una secuencia de bases que consiste en lasecuencia representada por la fórmula:

5'-(G)MPXCGYQ(G)N-3',

en la que C es citosina, G es guanina; X e Y son independientes entre sí y cada una representa una secuenciaarbitraria que tiene una longitud de 0 a 10 nucleótidos y no contiene 4 o más residuos de guanina consecutivos, y lalongitud de X + Y es de 6 a 20 nucleótidos; XCGY contiene una secuencia palindrómica que tiene una longitud,como mínimo, de 8 nucleótidos y tiene una longitud de 8 a 22 nucleótidos; P y Q son independientes entre sí yrepresentan un nucleótido diferente a guanina, y M representa un número entero de 6 a 10 y N representa unnúmero entero de 0 a 3; y cada longitud de nucleótidos de X e Y no necesita ser necesariamente la misma longitud,y que tiene una longitud de 16 a 37 nucleótidos en total, y

en la que la secuencia representada por la fórmula se selecciona del grupo que comprende las siguientes (a) - (f):

(a) la secuencia definida anteriormente en la que XCGY contiene GCGATCGC (SEQ ID NO: 63);

(b) la secuencia definida anteriormente en la que XCGY contiene GACGATCGTC (SEQ ID NO: 76);

(c) la secuencia definida anteriormente en la que XCGY contiene TCCGATCGGA (SEQ ID NO: 88);

(d) la secuencia definida anteriormente en la que XCGY contiene ATCGAT (SEQ ID NO: 60);

(e) la secuencia definida anteriormente en la que XCGY contiene GACGTC (SEQ ID NO: 61); y

(f) la secuencia definida anteriormente en la que la secuencia de bases consiste en una secuencia de basesseleccionada del grupo que comprende las SEQ ID NO: 6, 7, 10, 15 a 17, 95 y 97.

Oligonucleótido inmunoestimulador y aplicación farmacéutica del mismo

Sector técnico

La presente invención se refiere a oligonucleótidos inmunoestimuladores y a la utilización de los mismos en productos farmacéuticos, y particularmente se refiere a nuevos oligonucleótidos mediante los cuales se aumenta la actividad de inducción de interferón (IFN) y se reduce la actividad de inducción de citoquinas inflamatorias, y los productos farmacéuticos que contienen los oligonucleótidos y la utilización de los mismos.

Antecedentes de la invención

Tokunaga y otros han informado que un tipo particular de ADN bacteriano estimula una respuesta inmune (Yamamoto y otros, Jpn. J. Cancer Res. 79:866-873, 1988) . Un componente importante del ADN bacteriano esencial para la actividad inmunoestimuladora es una estructura de secuencia corta característica que contiene un motivo dinucleótido CpG (en adelante abreviado como CpG) que no está metilado. También se ha informado que un oligonucleótido que contiene CpG sintetizado induce la producción de IFN de tipo I (IFN-a e IFN-º) y el IFN-γ en macrófagos y células asesinas naturales (NK) y tiene una la actividad citotóxica de las células NK (JP Hei-4-352724-A) . También se ha informado que el oligonucleótido que contiene CpG no sólo actúa sobre los macrófagos, sino también sobre células dendríticas y células B e induce actividad de proliferación celular y la producción de citoquinas inflamatorias de interleucina-12 (IL-12) , factor de necrosis tumoral (TNF-a) e interleucina-6 (IL-6) (Klinman y otros, Proc. Natl. Acad. Sci., 93:2879-2883, 1996) . Por tanto, el oligonucleótido que contiene CpG es útil como coadyuvante de una vacuna y para el tratamiento de enfermedades alérgicas, ya que induce inmunidad celular y respuestas Th1. Por otro lado, no puede negarse que el oligonucleótido que contiene CpG podría provocar efectos secundarios tales como sepsis, fiebre, dolor articular, dolor muscular y enrojecimiento porque induce la producción de TNF-a e IL-6.

Tokunaga y otros han descubierto que el oligonucleótido que contiene el motivo CpG y compuesto de un motivo de 6 bases palindrómicas tiene una fuerte actividad en la actividad citotóxica de las células NK murinas, y han informado que las secuencias de 5'-AACGTT-3' (SEQ ID NO: 92) , 5'-AGCGCT-3' (SEQ ID NO: 93) y 5'-GACGTC-3' (SEQ ID NO: 61) tienen la mayor actividad (Yamamoto y otros, . J. Immunol., 148:4072-4076, 1992) . Se ha informado sobre otros tipos de secuencias de oligonucleótidos inmunoestimuladores (Publicación Internacional No. 1998/ 18810, Publicación Internacional No. 2003/015711, Publicación internacional No. 2004/058179) .

También se han llevado a cabo estudios con el fin de aumentar la actividad de los oligonucleótidos. Tokunaga y otros han descubierto que la actividad de las células NK y la actividad de inductores de IFN aumentan cuando una estructura repetitiva de ácido deoxiguanílico (secuencia poli-G) se inserta fuera del motivo de 6 bases palindrómicas que contiene CpG (JP Hei-4-352724- A) . Se ha demostrado también que la secuencia fuera de la secuencia de 6 bases que contiene el motivo CpG no tiene poco efecto sobre la actividad.

Las otras secuencias que contienen CpG conocidas públicamente son de tipo D (o de tipo A) y de tipo K (o de tipo B) de oligonucleótidos inmunoestimuladores (Publicación Internacional N º 2000/61151 panfleto) . El tipo K es conocido para activar las células B. El tipo D, en el que se añade una secuencia poli-D fuera de la secuencia palíndrómica que contiene CpG, induce la producción de IFN de tipo I en las células dendríticas y activa las células NK humanas. Se ha descrito que, para la actividad inductora de IFN del tipo D, el lado del extremo 3' es importante, y son necesarias 4 o más bases para la longitud de la secuencia poli-G en el extremo 3' (Publicación Internacional No. 2000/61151 panfleto) . Por otra parte, se ha descrito también que la secuencia poli-G en el lado del extremo 3' es importante para las actividades inductoras de la producción de citoquinas inflamatorias de IL-12 y TNF-a, y se requiere una secuencia poli-G, como mínimo, de 4 o más bases para provocar estos efectos (Corea KR 2001-063153) . Por lo tanto, las secuencias de los oligonucleótidos conocidos públicamente que aumentan las actividades inmunoestimuladoras, o la estructura de una secuencia poli-G no revelan una independencia de la inducción de IFN y la inducción de citoquinas inflamatorias.

Se ha descubierto que el nucleótido inmunoestimulador que tiene el motivo palíndromo de 5'-GACGATCGTC-3' (SEQ ID NO: 76) tiene una mayor actividad de inducción de IFN-a que los nucleótidos inmunoestimuladores que contienen CpG no modificados convencionales (el efecto de los modificados se describirá más adelante) , mediante la inserción de una secuencia poli-G que tiene una longitud adecuada de hasta 10 en el extremos 3’ y el extremo 5' (JP 2005-237328-A) . Se ha descrito que para conferir una mayor actividad de inducción de IFN-a a los nucleótidos inmunoestimuladores que tienen 5'-GACGATCGTC-3 ' (SEQ ID NO: 76) , es mejor poner de 8 a 10 bases G en el extremo 3’ o en el extremo 5', pero para inhibir la producción de interleucina-10 (IL-10) , que es una citoquina inmunosupresora, es mejor poner de forma desigual la base o bases en el extremo 5' solamente (JP 2005-237328-A) . También se ha informado que la actividad de inducción de las citoquinas inflamatorias de TNF-a e IL-12 se correlaciona moderadamente a la actividad de inducción de IFN-a. Estos no revelan efecto mediante la inserción de la secuencia poli-G en el extremo 5' en una secuencia de palíndromo distinta a 5'-GACGATCGTC-3' (SEQ ID NO: 76) . Un número de bases óptimo de la secuencia poli-G del oligonucleótido que contiene CpG, mediante el que se

atenúa la actividad para inducir una citoquina inflamatoria y se aumenta la actividad de inducción de IFN tanto para IFN-γ como para IFN-a, no se da a conocer.

5'-GGTGCCGATCGGCAGGGGGG-3' (SEQ ID NO: 1) se ha descubierto como un oligonucleótido que tiene una mayor actividad inmunoestimuladora que el oligonucleótido CpG de tipo D convencional (JP 2004-287102-A panfleto) . También se han descrito derivados obtenidos por sustitución de una o varias bases en esta secuencia de bases. Aunque no se ha dado a conocer ninguna secuencia específica obtenida mediante la sustitución de 3 o más bases, se ha descubierto sólo una secuencia, 5'-GGGGGGTGCCGATCGGCAGGG-3 ' (SEQ ID NO: 5) , obtenida por la sustitución de 7 bases, que tiene actividad inductora de IFN, incluso cuando la secuencia poli-G en el extremo 3' está compuesta de tres bases (Publicación Internacional No. 2006/035939) .

En relación con el otro estudio con el fin de aumentar la actividad, se ha conocido la estabilización del oligonucleótido mediante modificación química. Los nucleótidos fosfodiéster naturales se degradan fácilmente por diversas actividades de degradación de ácidos nucleicos en las células y en cultivos de células. Por lo tanto, se ha estudiado que los nucleótidos fosfodiéster se estabilizan mediante la sustitución de un enlace fosfodiéster internucleotídico, que es un objetivo de ataque de la actividad de degradación de ácidos nucleicos, y la actividad resultante aumenta. Una sustitución frecuentemente utilizada es la sustitución de fosforotioato. El estudio de Klinman y otros ha demostrado que la inducción de la respuesta inmune aumenta mediante la modificación de una secuencia poli-G fuera el motivo palíndromo con fosforotioato (Publicación Internacional No. 2000/61151) .

Se ha descubierto en el estudio con ratones “knock-out” TLR9 que un receptor para el ADN bacteriano que contiene CpG no metilado es TLR9, que es uno de los miembros de la familia de receptores de tipo Toll (TLR) (Hemmi, y otros, Nature, 408:740-745, 2000) . Se ha demostrado también que las secuencias de CpG óptimas para activar TLR9 humano y TLR9 murino son diferentes, lo que indica la presencia de especificidad de especies (Bauer y otros, PNAS, 98 (16) : 9237-9242, 2001) . En el desarrollo con el propósito de una terapia en humanos, es esencial que el tenga una elevada afinidad por el TLR9 humano. Además, es importante que el oligonucleótido actúe sobre animales, tales como ratones, en los estudios preclínicos utilizando animales que están en fase de desarrollo.

Para el tratamiento de enfermedades alérgicas, no se ha deseado un tratamiento sintomático utilizado con frecuencia en la actualidad, sino un tipo inmunorregulador y un... [Seguir leyendo]

1. Oligonucleótido inmunoestimulador que está constituido por una secuencia de bases que consiste en la secuencia representada por la fórmula:

5'- (G) MPXCGYQ (G) N-3',

en la que C es citosina, G es guanina; X e Y son independientes entre sí y cada una representa una secuencia arbitraria que tiene una longitud de 0 a 10 nucleótidos y no contiene 4 o más residuos de guanina consecutivos, y la longitud de X + Y es de 6 a 20 nucleótidos; XCGY contiene una secuencia palindrómica que tiene una longitud, como mínimo, de 8 nucleótidos y tiene una longitud de 8 a 22 nucleótidos; P y Q son independientes entre sí y representan un nucleótido diferente a guanina, y M representa un número entero de 6 a 10 y N representa un número entero de 0 a 3; y cada longitud de nucleótidos de X e Y no necesita ser necesariamente la misma longitud,

y que tiene una longitud de 16 a 37 nucleótidos en total, y en la que la secuencia representada por la fórmula se selecciona del grupo que comprende las siguientes (a) – (f) :

(a) la secuencia definida anteriormente en la que XCGY contiene GCGATCGC (SEQ ID NO: 63) ;

(b) la secuencia definida anteriormente en la que XCGY contiene GACGATCGTC (SEQ ID NO: 76) ;

(c) la secuencia definida anteriormente en la que XCGY contiene TCCGATCGGA (SEQ ID NO: 88) ;

(d) la secuencia definida anteriormente en la que XCGY contiene ATCGAT (SEQ ID NO: 60) ;

(e) la secuencia definida anteriormente en la que XCGY contiene GACGTC (SEQ ID NO: 61) ; y

(f) la secuencia definida anteriormente en la que la secuencia de bases consiste en una secuencia de bases seleccionada del grupo que comprende las SEQ ID NO: 6, 7, 10, 15 a 17, 95 y 97.

2. Oligonucleótido inmunoestimulador, según la reivindicación 1, en el que XCGY tiene una longitud de 9 ó 10 nucleótidos y la longitud total es de 17 a 23 nucleótidos.

3. Oligonucleótido inmunoestimulador, según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la secuencia representada por la fórmula es la secuencia de (b) .

4. Oligonucleótido inmunoestimulador, según la reivindicación 3, en el que la secuencia de bases del oligonucleótido inmunoestimulador que contiene la secuencia de (b) consiste en una secuencia de bases seleccionada del grupo que comprende las SEQ ID NO: 28, 48 y 50 a 52.

5. Oligonucleótido inmunoestimulador, según la reivindicación 1, en el que la secuencia de bases del oligonucleótido inmunoestimulador que contiene una secuencia seleccionada del grupo que comprende las secuencias (a) a (c) consiste en una secuencia de bases seleccionada del grupo que comprende las SEQ ID NO: 24, 26, 28, 48, y 50 a 52.

6. Oligonucleótido inmunoestimulador, según la reivindicación 1, en el que la secuencia de bases del oligonucleótido inmunoestimulador que contiene la secuencia de (d) consiste en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 30.

7. Oligonucleótido inmunoestimulador, según la reivindicación 1, en el que la secuencia de bases del oligonucleótido inmunoestimulador que contiene la secuencia de (e) consiste en la secuencia de bases de las SEQ ID NO: 40 ó 42.

8. Oligonucleótido inmunoestimulador, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que un enlace fosfodiéster en todos o una parte de los enlaces internucleotídicos se modifican con fosforotioato.

9. Oligonucleótido inmunoestimulador, según la reivindicación 8, en el que el enlace fosfodiéster, como mínimo, de una parte de los enlaces internucleotídicos, en una secuencia consecutiva de G en el extremo 5' se modifica con fosforotioato.

10. Oligonucleótido inmunoestimulador, según la reivindicación 8 ó 9, en el que el enlace fosfodiéster, como mínimo de una parte de los enlaces internucleotídicos, en el extremo 3' se modifica con fosforotioato.

11. Producto farmacéutico que contiene el oligonucleótido inmunoestimulador, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, como ingrediente activo.

12. Oligonucleótido inmunoestimulador, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para utilizar en un método de tratamiento o prevención de una enfermedad alérgica.

13. Oligonucleótido inmunoestimulador, según la reivindicación 12, en el que dicha enfermedad alérgica es una 5 enfermedad de alergia al polen.

14. Vacuna que comprende el oligonucleótido inmunoestimulador, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, como coadyuvante.

15. Oligonucleótido inmunoestimulador, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para utilizar en un método de tratamiento o prevención de la hepatitis.