PROCEDIMIENTO PARA OBTENER UNA COMPOSICION DE IgG MEDIANTE TRATAMIENTO TERMICO.

Procedimiento para obtener una composición de IgG mediante tratamiento térmico.

La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento de obtención de una composición de IgG a partir de una solución de IgG parcialmente purificada de plasma humano, en el que aplicando un tratamiento térmico intermedio y sin utilizar reactivos para la precipitación de agregados/polímeros y/o proteínas de alto peso molecular, se obtiene una eliminación prácticamente total de los polímeros de IgG generados durante el proceso. Además, dicho procedimiento presenta una elevada productividad, menores costes de producción y un fácil manejo, en comparación con los procedimientos de la técnica anterior. Por otra parte, con la utilización de dicho procedimiento se proporciona estabilidad al producto final en líquido.

Procedimiento para obtener una composición de IgG mediante tratamiento térmico

La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento de obtención de una composición de IgG a partir de una solución de IgG parcialmente purificada de plasma humano, en el que aplicando un tratamiento térmico intermedio y sin utilizar reactivos para la precipitación de agregados/polímeros y/o proteínas de alto peso molecular, se obtiene una eliminación prácticamente total de los polímeros de IgG generados durante el proceso. Además, dicho procedimiento presenta una elevada productividad, menores costes de producción y un fácil manejo, en comparación con los procedimientos de la técnica anterior. Por otra parte, con la utilización de dicho procedimiento se proporciona estabilidad al producto final en líquido.

La inmunoglobulina G (IgG) es el isotipo de inmunoglobulina más abundante en el suero humano (8-16 mg/ml) y constituye aproximadamente el 80% de todas las inmunoglobulinas. La IgG está indicada para el tratamiento de diversas enfermedades tales como la inmunodeficiencia primaria, en particular la agamaglobulinemia congénita y la hipogamaglobulinemia, la Púrpura Trombocitopénica Idiopática, como adyuvante en el tratamiento de la Enfermedad de Kawasaki y en el trasplante de médula ósea, hipogamaglobulinemia asociada con leucemia linfocítica crónica, como parte del tratamiento de la infección por HIV en pacientes pediátricos, entre otras.

En la actualidad, existe una alta demanda de inmunoglobulina G (IgG) polivalente con amplio espectro de anticuerpos humanos y total funcionalidad (capacidad neutralizante, opsonización, vida media conservada) , que presente moléculas intactas (integridad del fragmento cristalizable Fc) y una distribución normal de subclases de IgG igual o equivalente al plasma nativo, especialmente para las subclases minoritarias (IgG3 e IgG4) .

Las rutas de administración terapéutica de la IgG pueden ser la vía intravenosa, subcutánea e intramuscular, incluso se puede administrar por otras vías menos convencionales tales como la vía oral, inhalada o tópica.

Sin embargo, la administración intravenosa ofrece las indicaciones terapéuticas más interesantes, sea para el tratamiento de las inmunodeficiencias primarias o para la inmunodeficiencia común variable (déficit de subclases de IgG, de IgA) (Espanol, T. “Primar y immunodeficiences”. Pharmaceutical Policy and Law. 2009; 11 (4) : 277-283) , las inmunodeficiencias secundarias o adquiridas (por ejemplo, infección por virus tales como citomegalovirus, herpes zoster, inmunodeficiencia humana) , y las enfermedades de origen autoinmune (púrpura trombocitopénica, síndrome de Kawasaki, como ejemplos) (Koski, C. “Immunoglobulin use in management of inflammator y neuropathy”. Pharmaceutical Policy and Law. 2009; 11 (4) : 307-315) .

De forma ideal, la IgG para uso intravenoso (IGIV) debe formularse a una alta concentración en líquido y preferentemente debe ser almacenable hasta aproximadamente 30ºC para facilitar la conservación del producto y su infusión inmediata.

Se ha descrito que para reducir posibles reacciones de intolerancia de la IgG es necesaria la ausencia, o una cantidad no detectable, de inmunoglobulina A (IgA) e inmunoglobulina M (IgM) , así como de aglutininas de grupo sanguíneo. También es imprescindible que el producto esté prácticamente libre de cualquier actividad enzimática, tanto por presencia de plasmina, o plasminógeno, como de precalicreína, o su activador, quininas o quininógeno, o factores de coagulación tales como factor XI/factor XIa, entre otros.

Por otro lado, la procedencia humana del plasma de partida para obtener la IgG polivalente obliga a reducir al mínimo el riesgo de infección por transmisión de virus o patógenos. Tal y como describieron Fernandes y otros (ES 500121) e Hirao, Y. y otros (EP 196761 y EP 253313) , el tratamiento térmico en solución (líquido) de la IgG, o pasteurización, puede realizarse de forma eficaz en presencia de protectores contra la desnaturalización de la IgG (sacarosa, sorbitol, aminoácidos, por ejemplo) . Para ello se lleva la solución a una temperatura aproximadamente de 60ºC durante, como mínimo, unas 10 horas, inactivando o atenuando los patógenos más peligrosos. Estos patógenos pueden ser con envoltura lipídica tales como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , el virus de la hepatitis C (VHC) y el virus de la hepatitis B (VHB) , o sin dicha envoltura, tales como el poliovirus, el virus de la hepatitis A (VHA) , parvovirus, entre otros (Uemura Y. y otros. “Inactivation and elimination of viruses during the fractionation of an intravenous immunoglobulin preparation”. Vox Sang. 1989; 56: 155-161) .

No obstante, la pasteurización, incluso en presencia de estabilizantes y en las mejores condiciones de proceso, conlleva inevitablemente la formación de agregados irreversibles de proteína de alto peso molecular tales como polímeros de IgG y/o de otras proteínas acompañantes, en mayor o menor proporción en dependencia de la pureza de la IgG de partida (Hirao, Y. y otros. supra; y Ristol, P. y otros. EP 1225180 y ES 2091161) .

En la década de 1960-1970, la presencia de agregados irreversibles de alto peso molecular, denominados polímeros de IgG, fue asociada al consumo del complemento por activación del mismo (actividad anticomplementaria, ACA) durante la administración intravenosa de IgG, y éste fenómeno se vinculó a las graves reacciones de intolerancia o anafilaxis observadas (Barandum, S. y otros. Vox Sang. 7: 157-174, 1962) . Por ello, las autoridades sanitarias regularon el contenido máximo de polímeros, o formas moleculares superiores a dímeros, de las

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IGIV hasta un límite del 3% (Monografía de Eur.Ph. 6.3; y CMP Core SPC for human normal immunoglobulin for intravenous administration: CPMP/BPWG/859/95 rev.2) . Esta consideración es especialmente importante para una formulación líquida, puesto que el límite del 3% debe mantenerse igualmente hasta la fecha de caducidad del producto. Por tanto, existe la necesidad de conseguir una ausencia prácticamente total de dichos polímeros de IgG, tanto después de la pasteurización como en el producto final obtenido, para garantizar la inalterabilidad del producto a largo plazo y la máxima temperatura de conservación posible.

Actualmente, la mayoría de las IgG líquidas disponibles en el mercado y formuladas con aminoácidos, deben mantenerse a pH ácido para evitar la agregación (Uemura, Y. “Dissociation of aggregated IgG and denaturation of monomeric IgG by acid treatment”. Tohoku J. Exp. Med., 1983; 141: 337-349) , preferentemente entre pH 4, 0 - 5, 0 (Tenold, R. y otros. US-4396608) , y a una temperatura de 2-8ºC si están estabilizadas con glicina 0, 2M ó 0, 25M tales como las conocidas con los nombres comerciales de Gamunex® (Grifols SA, España) , Kiovig® o Gammagard® Liquid (ambas de Baxter, Estados Unidos) , o hasta 25ºC si se estabiliza con prolina 0, 25M tal como Privigen® (CSL Behring, Alemania) , con el objetivo de minimizar la agregación molecular durante la conservación (Jolles, S. y otros. “Clinical uses of intravenous immunoglobulin” Clin Exp Immunol. 2005 October; 142 (1) : 1-11; Hooper, JA. “Intravenous immunoglobulins: evolution of commercial IVIG preparations”. Immunol Allergy Clin North Am. 2008; 28 (4) : 765-778) .

Se ha comprobado que un pH excesivamente ácido durante un largo período de exposición favorece la fragmentación de la IgG, por ejemplo a un pH igual o inferior a 4, 5 y una temperatura relativamente alta, por ejemplo a 30ºC (Vermeer, A. y otros. “Thermal stability of immunoglobulin: Unfolding and aggregation of a multi-domain protein”. Biophys. J. 2000; 78: 394-404; Shukla, A. y otros. “Strategies to address aggregation during protein A chromatography”. Bioprocess International, May 2005) . Así, por ejemplo, se ha reportado en la literatura que composiciones de IGIV al 10% formulada con L-prolina a pH 4, 8 ± 0, 2 son suficientemente estables en cuanto a agregación molecular, pero se observa una tendencia a la fragmentación con el tiempo de exposición. Así, a una temperatura de 25ºC, los fragmentos son en promedio del 3, 9% después de 36 meses (Cramer, M. y otros. “Stability over 36 months of a new liquid 10% polyclonal immunoglobulin product (IgPro10, Privigen®) stabilized with L-proline”. Vox Sang. 2009. DOI: 10.1111/j.14230410.2008.01143.x) .

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1. Procedimiento de obtención de una composición de IgG a partir de una solución de IgG

parcialmente purificada de plasma humano que comprende las etapas de:

a) diafiltrar la solución de IgG parcialmente purificada;

b) estabilizar la solución obtenida en la etapa a) ;

c) tratar térmicamente la solución obtenida en la etapa b) ;

d) adsorber de la solución tratada térmicamente en la etapa c) los agregados y/o polímeros de alto peso molecular de forma selectiva mediante cromatografía catiónica; y

e) diafiltrar y formular la solución obtenida en la etapa d) .

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho procedimiento se lleva a cabo a partir de una solución de IgG purificada del plasma humano con un contenido de IgG respecto al total de proteínas mayor del 95%.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicho procedimiento se lleva a cabo a partir de una solución de IgG purificada del plasma humano con un contenido de IgG respecto al total de proteínas mayor del 97%.

4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa de diafiltración (a) se lleva a cabo hasta que la concentración de etanol sea menor de un 0, 5% (peso/volumen) , preferentemente menor de un 0, 1 % (peso/volumen) .

5. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa de diafiltración (a) se lleva a cabo hasta que la concentración de los reactivos de precipitación no desnaturalizantes tales como PEG, ácido octanoico, detergentes no iónicos compatibles, o cualquier mezcla de ellos, sea menor de un 2% (peso/volumen) y en cualquier caso no provoquen más del 3% de polímero después de la etapa c) .

6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa de diafiltración (a) se lleva a cabo hasta que la fuerza iónica de la solución de IgG de partida sea menor a 1 mS/cm.

7. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el valor de pH al final de la etapa (a) se encuentra en el intervalo entre 4, 2 y 6, 0.

8. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa de diafiltración (a) se lleva a cabo frente a agua para inyección o frente a una solución tampón de baja fuerza iónica.

9. Procedimiento, según la reivindicación 8, caracterizado porque la solución tampón de baja fuerza iónica es una solución de ácido acético o acetato sódico : 5 mM, que tiene un pH entre 4, 0-5, 0.

10. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa de diafiltración (a) se lleva a cabo en modo de flujo tangencial a través de membranas con un corte molecular de entre 10 kDa y 100 kDa.

11. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en la etapa de diafiltración (a) las proteínas se concentran hasta una concentración no mayor de un 5% (peso/volumen) , preferentemente entre un 2% y un 4% (peso/volumen) .

12. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en la etapa de estabilización (b) se utiliza sorbitol como agente estabilizador.

13. Procedimiento, según la reivindicación 12, caracterizado porque la concentración del sorbitol utilizado en la etapa de estabilización (b) es menor de 50% (peso/peso) , preferentemente se encuentra entr.

30. 35% en peso.

14. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en la etapa de estabilización (b) el pH se ajusta entre 4, 6 y 5, 2.

15. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el tratamiento térmico (etapa c) se lleva a cabo a una temperatura entre 55ºC y 63ºC, durante un tiempo entre 1 y 24 horas.

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16. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el

tratamiento térmico (etapa c) se lleva a cabo a una temperatura de 60 ± 1ºC, durante 10-11 horas.

17. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa de adsorción selectiva se lleva a cabo en una columna cromatográfica de intercambio catiónico fuerte.

18. Procedimiento, según la reivindicación 17, caracterizado porque la resina de intercambio catiónico fuerte, comprende, como mínimo, alguno de los grupos sulfónicos catiónicos tales como sulfonilo, sulfónico, o sulfopropilo, unido covalentemente a una matriz sintética insoluble de perfusión, compuesta por polimetacrilato o poliestireno y cuyo tamaño de partículas oscila entr.

2. 100 μm.

19. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en la etapa de adsorción selectiva el caudal de inyección es de 5-30 volúmenes de columna/hora.

20. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la solución tratada térmicamente en la etapa c) se le añade cloruro sódico hasta una concentración final entre 0, 2 y 0, 5 M (mol/litro) .

21. Procedimiento, según cualquiera la reivindicación 20, caracterizado porque la solución de la etapa c) después de añadir el cloruro sódico se ajusta a un pH entre 4, 2 y 5, 5.

22. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en la etapa de adsorción selectiva se utiliza entre 1 y 10 litros de resina por cada kg de IgG (seca) a purificar, lo que equivale a una carga de entre 100 y 1000 mg de IgG/ml de resina.

23. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en la etapa de adsorción selectiva la elución se lleva a cabo utilizando un gradiente salino decreciente.

24. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho procedimiento comprende, como mínimo, una etapa adicional de tratamiento de inactivación/eliminación vírica.

25. Procedimiento, según la reivindicación 22, caracterizado porque las etapas adicionales de tratamiento de inactivación/eliminación vírica se llevan a cabo antes o después de la etapa de tratamiento térmico.

26. Procedimiento, según la reivindicación 22, caracterizado porque la etapa adicional de tratamiento de inactivación/eliminación vírica se lleva a cabo por incubación a pH ácido en presencia o no de pepsina, o mediante tratamiento con detergentes no-iónicos, disolventes orgánicos o mediante nanofiltración

27. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa de diafiltración (e) se lleva a cabo frente a agua para inyección o frente a una solución tampón de baja fuerza iónica.

28. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en la etapa de diafiltración (e) se añaden estabilizantes para la formulación final.

29. Procedimiento, según la reivindicación 28, caracterizado porque el pH de la formulación final se encuentra entre 4, 6 y 5, 8.

30. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa de diafiltración (e) se lleva a cabo en modo de flujo tangencial a través de membranas con un corte molecular de entre 10 kDa y 100 kDa.

31. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en la etapa de diafiltración (e) las proteínas se concentran hasta un valor entre un 5% y un 22% (p/v) .