PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DE ESTRUCTURAS COCLEARES, COMPOSICIONES DE VACUNA, ADYUVANTES Y SUS INTERMEDIOS.

La presente invención se relaciona con el campo de la Inmunología,

específicamente con la rama de los adyuvantes y las vacunas. El objetivo técnico que se persigue es obtener estructuras cocleares a partir de vesículas de membrana externa (ampollas) de microorganismos, con el fin de emplearlas como adyuvantes o como vacunas en sí. La invención también se relaciona con el método de obtención de las estructuras cocleares.

Procedimiento de obtención de estructuras cocleares, composiciones de vacuna, adyuvantes y sus intermedios La presente invención tiene aplicaciones en el campo de la inmunología, específicamente en el ámbito de adyuvantes y vacunas.

En la búsqueda de vacunas eficaces, el descubrimiento de antígenos adecuados ha demostrado ser un desafío en varios ámbitos de conocimiento más allá de la vacunología. Una vez que el antígeno apropiado ha sido aislado, este último a menudo produce un efecto inmunológico que es insuficiente para los fines en cuestión, o no induce los efectos deseados, exigiendo la aplicación de adyuvantes adecuados. La elaboración de vacunas para enfermedades para las cuales actualmente no existe protección, así como la mejora de las vacunas existentes y el desarrollo de adyuvantes potentes para su uso en vacunas múltiples y de nueva generación, constituye, a día de hoy, una necesidad urgente. También lo es el desarrollo de vacunas que incluyan diferentes antígenos y demuestren ser eficaces tanto en el tratamiento de adultos como de niños y, lo más importante, en el de recién nacidos, así como el descubrimiento de adyuvantes que funcionen a nivel de la mucosa y sean capaces de resistir el contenido ácido del estómago.

La inmunización mucosal es una práctica vacunológica cada vez más extendida, dado que muchos microorganismos penetran en el cuerpo a través de las membranas mucosas. Las mucosas presentan una serie de particularidades, incluyendo: la existencia de un sistema mucoso común (que permite inducir respuestas locales así como distantes) , y el hecho de que la Ig (inmunoglobulina) A es el principal anticuerpo empleado en sus mecanismos de defensa inmunológica.

Este tipo de inmunización también ofrece una serie de ventajas, incluyendo una administración sencilla que no requiere el uso de jeringas, un menor coste de producción y un nivel más bajo de reactogénesis, lo que le hace mucho más seguro con respecto a vacunas parenterales y la inducción de reacciones tanto mucosales como sistémicas. La inmunización mucosal, sin embargo, se encuentra con una serie de obstáculos: el contenido ácido del estómago, que alcanza niveles de pH extremadamente ácidos; la basicidad del duodeno y la peristalsis del tracto digestivo que, en combinación con la acción de células M de órganos inductores que actúan a nivel de la mucosa, especializadas en el muestreo de antígenos, reduce la eficacia de los antígenos en la vacuna. Los cilios y las formaciones mucosas en los órganos de la mucosa respiratoria también interfieren en el muestreo de los antígenos por parte de las células M. La presente estrategia usada para evitar el contacto del antígeno con un medio de pH ácido consiste en la administración de vacunas en soluciones bicarbonatadas en momentos muy alejados de las horas de las comidas, para reducir la acidez del estómago y asegurar un rápido paso a través de éste (Benitez JA et al., Infect and Immun 1999, 67 (2) : 539-545) , o el recubrimiento de los antígenos con agentes resistentes a sustancias ácidas, tales como liposomas.

Actualmente, se conocen bien los procedimientos usados en la preparación de liposomas, y en el recubrimiento de materiales liposolubles sólidos, (Schneider Patente de Estados Unidos Nº 4.089.801, Ash et al., Patente de Estados Unidos Nº 4.448.765 y Miller et al., Patente de Estados Unidos Nº 4.133.874) . Los principales problemas planteados por la encapsulación de materiales farmacéuticos en liposomas incluyen: la poca estabilidad que muestra en ensayos de laboratorio; la liberación del material encapsulado; la reducción de la eficacia del fármaco; la susceptibilidad mostrada a condiciones medioambientales adversas, digestión en el tracto gastrointestinal y fusión indirecta con membranas celulares (http://www.BDSiAdvantages.html) . Por otro lado, los liposomas son estructuras inestables que, en su mayor parte, no pueden ser liofilizadas, un problema que se ha superado mediante el desarrollo de estructuras cocleares.

Los cocleatos son estructuras lipídicas multilaminares enrolladas en forma de conchas marinas. La producción de cocleatos mediante la fusión de liposomas unilaminares y el empleo de cationes divalentes, es una práctica bien conocida (D. Papahadjopolous et al., Biochem. Biophys. Acta, 1975; 394: 483) . Este procedimiento ha sido modificado para producir una suspensión de vesículas multilaminares que contienen y están rodeadas por el antígeno. Este último se convierte en pequeñas vesículas proteicas lipídicas unilaminares mediante sonicación en nitrógeno, que se realiza para formar los cocleatos en presencia de iones divalentes (Gould-Fogerite et al. Patente de Estados Unidos Nº 5.643.574, 1 de julio de 1997) . Estas técnicas se resumen en la figura 1.

Los cocleatos, así como otras micro-estructuras auto-ensambladas, se han empleado en la administración de agentes terapéuticos (Yager, et al. Patente de Estados Unidos Nº 5.851.536, 22 de diciembre de 1998, Gould-Forgerite, et al. Patente de Estados Unidos Nº 5.994.318, 30 de noviembre de 1999 y Yager, et al. Patente de Estados Unidos Nº 6.180.114, 30 de enero de 2001) . Estos incluyen preparaciones de cocleatos que contienen adyuvantes (Gould-Fogerite et al. Patente de Estados Unidos Nº 5.994.318, 30 de noviembre de 1999) . Sin embargo, tanto liposomas como cocleatos deben obtenerse de lípidos negativos en presencia de colesterol, los cuales se extraen generalmente de animales en procedimientos costosos (Mannino et al. Patente de Estados Unidos Nº 4.663.161, 5 de mayo de 1987) que son cada vez menos aceptables a la luz de las nuevas normativas farmacéuticas y que incluyen preferiblemente una proteína purificada obtenida de un microorganismo, o un péptido, en el caso de preparaciones de vacuna. Además, debe señalarse que el uso de cocleatos obtenidos de vesículas de la membrana externa de organismos vivos como adyuvantes por derecho propio, o su preparación con otros activadores de señales importantes en la inducción de respuestas inmunológicas, tales como estructuras moleculares asociadas con patógenos (estructuras filogenéticamente conservadas para las que hay receptores en el huésped, y que son reconocidas como un signo de peligro por ese huésped) , no se ha considerado anteriormente.

El objetivo de la presente invención es obtener una nueva estructura coclear a partir de vesículas que se encuentran en en las membranas externas de organismos vivos, que presentan propiedades de adyuvante y de vacuna debido a su particular composición de proteínas y lipídica, así como a las estructuras moleculares asociadas a patógenos descubiertos en el organismo. Una vez formadas, las estructuras cocleares se homogeneizan a su propio tamaño para hacerlas más eficaces inmunológicamente. Las estructuras cocleares obtenidas mediante la presente invención se caracterizan por que, teniendo una composición proteolipídica hasta ahora no intentada por otros autores, son capaces de auto-ensamblarse y de producir estructuras enrolladas, en forma de concha marina. Las composiciones de proteínas y lipídicas de las estructuras cocleares dependerán de los microorganismos que han suministrado las vesículas de su membrana externa, es decir, dependerá de las características de las proteínas que se encuentran en su membrana. De la misma manera, las estructuras mencionadas contienen concentraciones de estructuras moleculares asociadas a patógenos, entre el 1 y el 7 % con respecto a la concentración de proteínas, suministrada por la membrana del microorganismo en cuestión, que se insertan y no se encuentran dentro en un estado libre. Además, estas estructuras pueden purificarse a partir de otros microorganismos y pueden añadirse a la preparación. Las estructuras añadidas y existentes deben estar a una concentración entre el 1 y el 30 % con respecto a la concentración de proteínas. Una de las estructuras moleculares asociadas a patógenos usada durante la producción de estructuras cocleares era el lipopolisacárido de Vibrio cholerae o N. meningitidis (ejemplo 20) .

Las estructuras cocleares obtenidas mediante la invención inducían una respuesta celular que demostró ser eficaz en lactantes alimentados con leche materna, mostraron propiedades de resistencia térmica así como ácida y básica, y - en conjunto - demostraron ser muy adecuadas para administración mucosal (ejemplos 2, 4, 6, 8 y 10) . Estas propiedades fueron útiles en el diseño de adyuvantes heterólogos (adyuvantes empleados para reforzar vacunas diferentes de las que producían las vesículas de la membrana externa) y vacunas homólogas (vacunas usadas contra el microorganismo que... [Seguir leyendo]

1. Composición de vacuna que contiene estructuras cocleares proteolipídicas obtenidas de vesículas que se encuentran en las membranas externas de organismos vivos, así como un excipiente adecuado, en la que dichas estructuras cocleares comprenden proteínas, lípidos y patrones moleculares asociados a patógenos.

2. Composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, completada con uno o más antígenos.

3. Composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 2, con dichos patrones moleculares asociados a patógenos añadidos a una concentración entre el 1 % y el 30 % del peso de la proteína de la estructura coclear.

4. Composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 3, con dichos patrones moleculares asociados a patógenos seleccionados entre el grupo constituido por lipopolisacáridos, peptidoglicano, lipoproteína, ácido teicoico, flagelina y lipofosfoglicano.

5. Composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque el organismo vivo que suministra las vesículas de la membrana externa es un organismo bacteriano, un protozoo o un organismo celular animal.

6. Composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada por el hecho de que dicha bacteria puede ser Gram negativa o Gram positiva.

7. Composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada por el hecho de que dicha bacteria Gram negativa puede ser del género Neisseria, Haemophilus, Salmonella, Vibrio, Pseudomonas o Shigella.

8. Composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada por el hecho de que dicha bacteria Gram positiva puede ser del género Streptococcus o Staphylococcus.

9. Composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada por el hecho de que dicho organismo vivo es el protozoo del género Leishmania.

10. Composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada por el hecho de que las estructuras cocleares se extraen de una célula tumoral.

11. Composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 2, encontrándose los antígenos incluidos adicionalmente en una proporción con respecto a las proteínas presentes en la estructura coclear de 0, 2 a 2, 7 μg a de 3 a 9 μg de proteína.

12. Composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 2, con los antígenos a incluir adicionalmente seleccionados entre el grupo constituido por: proteínas naturales o recombinantes, péptidos, sacáridos, ácidos nucleicos, conjugados o alérgenos.

13. Composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 12, siendo el antígeno añadido una proteína del virus de la hepatitis C.

14. Composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 12, siendo el antígeno añadido el epítopo T o B.

15. Adyuvante de vacuna que contiene estructuras cocleares proteolipídicas obtenidas de vesículas que se encuentran en las membranas externas de organismos vivos, en el que dichas estructuras cocleares comprenden proteínas, lípidos y patrones moleculares asociados a patógenos.

16. Adyuvante de vacuna de acuerdo con la reivindicación 15, encontrándose dichos patrones moleculares asociados a patógenos en una concentración entre el 1 % y el 30 % del peso de la proteína de la estructura.

17. Adyuvante de vacuna de acuerdo con la reivindicación 15, con dichos patrones moleculares asociados a patógenos seleccionados entre el grupo constituido por lipopolisacárido, peptidoglicano, lipoproteína, ácido teicoico, flagelina y lipofosfoglicano.

18. Adyuvante de vacuna de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado por el hecho de que el organismo vivo que suministra las vesículas de la membrana externa usadas para formar las estructuras cocleares es una bacteria, un protozoo o una célula animal.

19. Adyuvante de vacuna de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado por el hecho de que dicha bacteria es una Gram negativa o una Gram positiva.

20. Adyuvante de vacuna de acuerdo con la reivindicación 19, caracterizado por el hecho de que dicha bacteria Gram negativa es del género Neisseria, Haemophilus, Salmonella, Vibrio, Pseudomonas o Shigella.

21. Adyuvante de vacuna de acuerdo con la reivindicación 19, caracterizado por el hecho de que dicha bacteria Gram positiva es del género Streptococcus o Staphylococcus.

22. Adyuvante de vacuna de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado por el hecho de que dicho organismo vivo es un organismo protozoo del género Leishmania.

23. Adyuvante de vacuna de acuerdo con la reivindicación 18, derivando las estructuras cocleares de una célula tumoral.

24. Composición de vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 14, para su uso en una vacunación mucosal o parenteral o una combinación de éstas.

25. El adyuvante de acuerdo con las reivindicaciones 15 a 24, para su uso en una vacunación mucosal o parenteral

o una combinación de éstas.