NUEVOS COMPUESTOS DERIVADOS DE NEISSERIA MENINGITIDIS.

Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 97% con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4 e SEC ID Nº: 6

Nuevos compuestos derivados de neisseria meningitidis Campo de la invención La presente invención se refiere a polinucleótidos (denominados en lo sucesivo "polinucleótidos (s) BASB041"', a polipéptidos codificados por ellos (denominados en lo sucesivo "polipéptido (s) BASB041" o "BASB041") , a materiales recombinantes y a procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar dichos polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo vacunas contra infecciones bacterianas. En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos diagnósticos para detectar la infección por ciertos patógenos.

Antecedentes de la invención Neisseria meningitidis (meningococo) es una bacteria gramnegativa aislada frecuentemente del tracto respiratorio superior humano. En ocasiones provoca enfermedades invasivas bacterianas tales como bacteriemia y meningitis. La incidencia de la enfermedad meningocócica muestra diferencias geográficas estacionales y anuales (Schwartz, B., Moore, P. S., Broome, C. V.; Clin. Microbiol. Rev. 2 (Anexo) , S18-S24, 1989) . La mayoría de las enfermedades en países templados son debidas a cepas del serogrupo B y su incidencia varía desde 1-101100.000/población total al año, alcanzando a veces valores superiores (Kaczmarski, E. B. (1997) , Commun. Dis. Rep. Rev. 7: R55-9, 1995; Scholten, R. J. P. M., Bijlmer, H. A., Poolman, J. T. y col., Clin. Infect. Dis. 16: 237-246, 1993; Cruz, C., Pavez, G., Aguilar, E., y col., Epidemiol. Infect. 105: 119-126, 1990) .

Las epidemias dominadas por meningococos del serogrupo A, mayoritariamente en África central, se encuentra que a veces que alcanzan unos niveles de hasta 1. 000/100.000/año (Schwartz, B., Moore, P. S., Broome, C. V. Clin. Microbiol. Rev. 2 (Anexo) , S18-S24, 1989) . Prácticamente todos los casos en total de las enfermedades meningocócicas son provocadas por meningococos de los serogrupos A, B, C, W-135 e Y, y hay disponible una vacuna de polisacáridos tetravalente A, C, W-135, Y (Armand, J., Arminjon, F., Mynard, M. C., Lafaix, C., J. Biol. Stand. 10: 335-339, 1982) .

Las vacunas de polisacáridos se están mejorando actualmente mediante su conjugación química con proteínas portadoras (Lieberman, J. M., Chiu, S. S., Wong, V. K. y col., JAMA 275: 1499-1503, 1996) .

No hay disponible una vacuna para el serogrupo B, dado que se encontró que el polisacárido capsular B no era inmunógeno, muy probablemente porque comparte una similitud estructural con los componentes del hospedador (Wyle, F. A., Artenstein, M. S., Brandt, M. L. y col., J. Infect. Dis. 126: 514-522, 1972; Finne, J. M., Leinonen, M., Mäkelä, P. M., Lancet ii.: 355-357, 1983) .

Durante muchos años se han iniciado y llevado a cabo esfuerzos para desarrollar vacunas basadas en la membrana externa meningocócica (de Moraes, J. C., Perkins, B., Camargo, M. C. y col., Lancet 340: 1074-1078, 1992; Bjune, G., Hoiby, E. A. Gronnesby, J. K. y col., 338: 1093-1096, 1991) . Dichas vacunas han demostrado unas eficacias del 57% - 85% en niños (>4 años) y adolescentes.

En estas vacunas hay presentes muchos componentes de la membrana externa bacteriana, tales como PorA, PorB, Rmp, Opc, Opa, FrpB, y la contribución observada de estos componentes a la protección todavía necesita una definición adicional. Se han definido otros componentes de la membrana externa usando anticuerpos animales o humanos que pueden ser potencialmente relevantes para la inducción de una inmunidad protectora, tales como TbpB y NspA (Martin, D., Cadieux, N., Hamel, J., Brodeux, B. R., J. Exp. Med. 185: 1173-1183, 1997; Lissolo, L., Maitre-Wilmotte, C., Dumas, p. y col., Inf. Immun. 63: 884-890, 1995) . Los mecanismos de la inmunidad protectora implicarán una actividad bactericida mediada por anticuerpos y opsonofagocitosis.

Se ha usado un modelo animal de bacteriemia para combinar todos los mecanismos mediados por anticuerpos (Saukkonen, K., Leinonen, M., Abdillahi, H. Poolman, J. T., Vaccine 7: 325-328, 1989) . Generalmente se acepta que el mecanismo bactericida mediado por el componente del complemento tardío es crucial para la inmunidad frente a una enfermedad meningocócica (Ross, S. C., Rosenthal P. J., Berberic, H. M., Densen, P. J., Infect. Dis. 155: 12661275, 1987) .

En el documento WO99/57280 se desvelan varias proteínas de Nesseria meningtidis.

La frecuencia de las infecciones por Neisseria meningitidis se ha incrementado drásticamente en las pasadas décadas. Esto se ha atribuido a la aparición de múltiples cepas resistentes a antibióticos y a un incremento en la población de personas con sistemas inmunitarios debilitados. Ya no es excepcional aislar cepas de Neisseria meningitidis que son resistentes a algunos o todos los antibióticos estándar. Este fenómeno ha creado una necesidad médica y una demanda no satisfechas de nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, procedimientos de cribado de fármacos y pruebas diagnósticas para este organismo.

Resumen de la invención La presente invención se refiere a BASB041, en particular a polipéptidos BASB041 y a polinucleótidos BASB041, a materiales recombinantes y a procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar dichos polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo la prevención y el tratamiento de enfermedades microbianas, entre otros. En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos diagnósticos para detectar enfermedades asociadas con infecciones microbianas y trastornos asociados con dichas infecciones, tales como ensayos para detectar la expresión o la actividad de los polinucleótidos o polipéptidos BASB041.

Descripción de la invención La invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos BASB041, según se describe con mayor detalle a continuación. La invención se refiere especialmente a BASB041 con las secuencias de nucleótidos y aminoácidos establecidas en las SEC ID Nº: 1, 3, 5 y las SEC ID Nº: 2, 4, 6 respectivamente. Se entiende que en las secuencias enumeradas en la Lista de Secuencias, más abajo, "ADN" representa una ejemplificación de una forma de realización de la invención, dado que los expertos habituales en la materia reconocerán que dichas secuencias pueden emplearse provechosamente en polinucleótidos en general, incluyendo ribopolinucleótidos.

Polipéptidos En un aspecto de la invención se proporcionan polipéptidos de Neisseria meningitidis denominados en lo sucesivo "BASB041" y "polipéptidos BASB041", y composiciones que comprenden los mismos.

La presente invención prevé adicionalmente:

(a) un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 97%, muy preferiblemente de al menos el 97-99% o una identidad exacta, con la de las SEC ID Nº: 2, 4, 6.

(b) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene una identidad de al menos el 97%, más preferiblemente de al menos el 97-99% o una identidad exacta, con la de las SEC ID Nº: 1, 3, 5 sobre la longitud completa de las SEC ID Nº: 1, 3, 5 respectivamente.

(c) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 97%, más preferiblemente de al menos el 97-99% o una identidad exacta, con las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 2, 4, 6;

Los polipéptidos BASB041 proporcionados en las SEC ID Nº: 2, 4, 6 son los polipéptidos BASB041 de las cepas de Neisseria meningitidis ATCC 13090 y H44/76.

La invención también proporciona un fragmento inmunógeno de un polipéptido con la secuencia de las SEC ID Nº: 2, 4 ó 6 en el que el fragmento comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de las SEC ID Nº: 2, 4 ó 6 y que tiene la misma o prácticamente la misma actividad inmunógena que el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nº: 2, 4, 6. Es decir, el fragmento (si fuera necesario cuando se acopla a un portador) es capaz de provocar una respuesta inmunitaria que reconozca el polipéptido de las SEC ID Nº: 2, 4 ó 6. Dicho fragmento inmunógeno puede incluir, por ejemplo, el polipéptido BASB041 carente de una secuencia líder Nterminal, y/o un dominio transmembranal y/o un dominio de anclaje C terminal. En un aspecto preferido, el fragmento inmunógeno de BASB041 según la invención comprende sustancialmente todo el dominio extracelular de... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 97% con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4 e SEC ID Nº:

6.

2. Un polipéptido aislado según se reivindica en la reivindicación 1 en el que la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 99% con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4 e SEC ID Nº: 6.

3. El polipéptido según se reivindica en la reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4 e SEC ID Nº: 6.

4. Un polipéptido aislado de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6.

5. Una proteína de fusión que comprende el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 97% con la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nº: 2, 4 ó 6 sobre la longitud completa de las SEC ID Nº: 2, 4 ó 6 respectivamente.

7. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 97% con una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de las SEC ID Nº: 2, 4 ó 6 a lo largo de toda la región codificante.

8. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 97% con la de las SEC ID Nº: 1, 3 ó 5 sobre la longitud completa de las SEC ID Nº: 1, 3 ó 5 respectivamente.

9. Un polinucleótido aislado según se reivindica en la reivindicación 8 que tiene una identidad de al menos el 99% con la de las SEC ID Nº: 1, 3 ó 5 sobre la longitud completa de las SEC ID Nº: 1, 3 ó 5 respectivamente.

10. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4º la SEC ID Nº: 6.

11. Un polinucleótido aislado que comprende el polinucleótido de la SEC ID Nº: 1, la SEC ID Nº: 3 o la SEC ID Nº: 5.

12. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6 obtenible mediante el cribado de una genoteca apropiada en condiciones de hibridación rigurosas con una sonda marcada con la secuencia de la SEC ID Nº: 1, la SEC ID Nº: 3 o la SEC ID Nº: 5 o un fragmento de la SEC ID Nº: 1, la SEC ID Nº: 3 o la SEC ID Nº: 5.

13. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12 o un polinucleótido aislado que codifica para la proteína de fusión de la reivindicación 5.

14. El vector de expresión de la reivindicación 13 que es recombinante.

15. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la reivindicación 13 ó 14.

16. Un microorganismo vivo recombinante que comprende un vector de expresión según la reivindicación 13 ó 14.

17. Un procedimiento para producir un polipéptido una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende cultivar una célula hospedadora de la reivindicación 15 en unas condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido o proteína de fusión, y recuperar el polipéptido o la proteína de fusión a partir del medio de cultivo.

18. Un procedimiento para expresar un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, o un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de la reivindicación 5, que comprende transformar una célula hospedadora con un vector de expresión que comprende al menos uno de dichos polinucleótidos, y cultivar dicha célula hospedadora en unas condiciones suficientes para la expresión de uno cualquiera de dichos polinucleótidos.

19. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz del polipéptido o de la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un portador farmacéuticamente aceptable.

20. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12 y un portador farmacéuticamente aceptable.

21. La composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20, en la que dicha composición comprende al menos un antígeno cualquiera de Neisseria meningitidis.

22. Una composición de vacuna que comprende:

(i) una cantidad eficaz de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6, o un fragmento inmunógeno de un polipéptido con la secuencia de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6, en el que el fragmento comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6, y en el que el fragmento es capaz (si es necesario, cuando se acopla a un portador) de provocar una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6, o un polipéptido que comprende dicho fragmento inmunógeno;

(ii) un portador farmacéuticamente aceptable; y

(iii) un coadyuvante seleccionado del grupo que consiste en 3 Des-O-acilado monofosforil lípido A, QS21, QS21 y colesterol.

23. Una composición de vacuna que comprende:

(i) una cantidad eficaz de un polinucleótido que tiene una identidad de al menos el 85% con la de la SEC ID Nº: 1, la SEC ID Nº: 3 o la SEC ID Nº: 5;

(ii) un portador farmacéuticamente aceptable; y

(iii) un coadyuvante seleccionado del grupo que consiste en 3 Des-O-acilado monofosforil lípido A, QS21, QS21 y colesterol.

24. Una composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 23 en la que el portador comprende una emulsión de aceite en agua que comprende un aceite metabolizable.

25. Una composición de vacuna según la reivindicación 24 en la que el aceite metabolizable comprende escualeno, alfa tocoferol y Tween 80.

26. Un procedimiento de diagnóstico in vitro de una infección por Neisseria meningitidis, que comprende identificar si hay presente un polipéptido según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en una muestra biológica procedente de un animal sospechoso de tener dicha infección.

27. Un procedimiento de purificación de (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6, o (ii) un fragmento inmunógeno de un polipéptido con la secuencia de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6, en el que el fragmento comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6, y en el que el fragmento es capaz (si es necesario, cuando se acopla a un portador) de provocar una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6, o (iii) un polipéptido que comprende dicho fragmento inmunógeno, en el que dicho prodedimiento se elige del grupo que consiste en precipitación con sulfato amónico, precipitación con etanol, extracción ácida, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacciones hidrófobas, cromatografía de hidroxilapatito y cromatografía de lectina.

28. Un procedimiento para producir una composición de vacuna que comprende (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6, o (ii) un fragmento inmunógeno de un polipéptido con la secuencia de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6, en el que el fragmento comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6, y en el que el fragmento es capaz (si es necesario, cuando se acopla a un portador) de provocar una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6, o (iii) un polipéptido que comprende dicho fragmento inmunógeno, en el que el procedimiento comprende el procedimiento de la reivindicación 27 y comprende adicionalmente la etapa de formular dicho polipéptido o fragmento inmunógeno con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.

29. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido o proteína de fusión según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la preparación de un medicamento para prevenir la infección por Neisseria meningitidis.

30. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12 en la preparación de un medicamento para prevenir la infección por Neisseria meningitidis.

31. Uso de (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6, o (ii) un fragmento inmunógeno de un polipéptido con la secuencia de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6, en el que el fragmento comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6, y en el que el fragmento es capaz (si es necesario, cuando se acopla a un portador) de provocar una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6, o (iii) un polipéptido que comprende dicho fragmento inmunógeno, en la preparación de un medicamento para prevenir la infección por Neisseria meningitidis.

32. Uso de un polinucleótido que tiene una identidad de al menos el 85% con la de la SEC ID Nº: 1, la SEC ID Nº: 3

o la SEC ID Nº: 5, en la preparación de un medicamento para prevenir la infección por Neisseria meningitidis.

33. Un polipéptido o fragmento inmunógeno seleccionado del grupo que consiste en (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% 5 con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6;

(ii) un fragmento inmunógeno de un polipéptido con la secuencia de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6, en el que el fragmento comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6, y en el que el fragmento es capaz (si es necesario, cuando se acopla a un portador) de provocar una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID

Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6; y (iii) un polipéptido que comprende dicho fragmento inmunógeno, para su uso en la prevención de la infección por Neisseria meningitidis.

34. Un polinucleótido que tiene una identidad de al menos el 85% con la de la SEC ID Nº: 1, la SEC ID Nº: 3 o la 15 SEC ID Nº: 5, para su uso en la prevención de la infección por Neisseria meningitidis.

Figura 1: alineación de las secuencias polinucleotídicas de BASB041

La identidad de la SEC ID Nº: 1 está indicada por un punto, y unas comillas (“-“) indican un nucleótido ausente.

Figura 2: alineación de las secuencias polipeptídicas de BASB041

La identidad de la SEC ID Nº: 2 está indicada por un punto, y unas comillas (“-“) indican un aminoácido ausente.

Figura 3: análisis electroforético de BASB041. A: gel de poliacrilamida-SDS teñido con Coomassie de BASB041. B: inmunodetección del mismo gel usando un reactivo inmunitario anti-tetra-His.

Figura 4: reconocimiento de la proteína BASB041 en varias cepas de Neisseria meningitidis con sueros de ratones inmunizados con BASB041.

Figura 5: reconocimiento de la proteína BASB041 en varias cepas de Neisseria meningitidis con sueros de ratones inmunizados con BASB041.

Figura 6: anticuerpos anti-BASB041 en sueros convalecientes y en ratones inmunizados Figura 7: anticuerpos anti-BASB041 en sueros convalecientes y en ratones inmunizados Figura 8: análisis electroforético de BASB043 purificado. A: gel de poliacrilamida-SDS teñido con Coomassie de BASB043. B: inmunodetección del mismo gel usando un reactivo inmunitario anti-tetra-His.

Figura 9: reconocimiento de la proteína BASB043 en varias cepas de Neisseria meningitidis con sueros de ratones inmunizados con BASB043.

Figura 10: reconocimiento de la proteína BASB043 en varias cepas de Neisseria meningitidis con sueros de ratones inmunizados con BASB043.

Figura 11: anticuerpos anti-BASB043 en sueros convalecientes y en ratones inmunizados