Nuevo gen de elongasa y producción de ácidos grasos delta-9-poliinsaturados.

Un ácido nucleico aislado que comprende un secuencia de nucleótidos derivada de una planta que codifica un polipéptido el cual elonga ácido γ

-linolénico (C18:39,12,15) en al menos dos átomos de carbono y donde el ácido γ-linolénico (C18:36,9,12) no es elongado, seleccionado del grupo consistente de:

a) una secuencia de ácidos nucleicos representada en SEQ ID NO: 1

b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido representado en SEQ ID NO:2,

c) derivados del secuencia representada en SEQ ID NO:1, la cual codifica polipéptidos que tienen al menos 50% de homología con la secuencia que codifica las secuencias de aminoácidos representadas en SEQ ID NO:2 y secuencias que funcionan como una elongasa.

Nuevo Gen de Elongasa y Producción de Ácidos Grasos L- 9- Poliinsaturados Campo de la Invención Esta invención se relaciona con un nuevo gel de elongasa que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1 o derivados de la secuencia representada en SEQ ID NO: 1, la cual codifica polipéptidos que tienen al menos 50% de homología con la secuencia que codifica aminoácidos representada en SEQ ID NO: 2 secuencia que funciona como una elongasa, para un constructo de gen que comprende esta secuencia o dichos derivados antes mencionados y con su uso. La secuencia de ácidos nucleicos de la invención codifica un polipéptido que elonga un ácido a-linolénico (C18:3 d9, 12, 15) en al menos dos átomos de carbono y donde el ácido y-linolénico (C18:3 d6, 9, 12) no esta elongado. La invención se relaciona adicionalmente con vectores u organismos que comprenden un gen de elongasa que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1 o dichos derivados antes mencionados.

La invención se relaciona adicionalmente con un proceso para la producción de ácidos grasos poliinsaturados (= PUFA) con un organismo no humano que comprende el gen elongasa y organismo que produce altas cantidades de aceites y especialmente aceites con un alto contenido de ácidos grasos insaturados.

Antecedentes de la invención Ciertos productos y subproductos de procesos metabólicos de ocurrencia natural en células tienen utilidad en una amplia gama de industrias, incluyendo las industrias de alimentos, piensos, y farmacéutica. Estas moléculas, colectivamente denominadas "producto químicos finos" incluyen también lípidos y ácidos grasos donde una clase representativa de moléculas son ácidos grasos poliinsaturados. Los ácidos grasos poliinsaturados (=PUFA) se adicionan por ejemplo a formulas infantiles para crear un valor nutritivo más alto de tales formulas. Los PUFA tienen por ejemplo una influencia positiva en el nivel de colesterol de la sangre en humanos y por lo tanto son útiles en la protección contra enfermedades del corazón. Los productos químicos finos y los ácidos grasos poliinsaturados (=PUFA) pueden aislarse a partir de fuentes animales tales como por ejemplo pescado o ser producidos con microorganismos a través de cultivo de fermentación a larga escala de microorganismos desarrollados para producir y acumular o secretar grandes cantidades de una o más de las moléculas deseadas.

Microorganismos particularmente útiles para la producción de PUFAs son microorganismos tales como las algas Isochr y sis galbana, Phaedactylum tricornutum o Cr y pthecodinium sp., ciliados tales como Stylonychia o Colpidium, hongos tales como Mortierella, Entomophthora, Mucor o Thrausto-/Schizochytrium sp. A través de la selección de cepas, se ha desarrollado un cierto número de cepas mutantes de los respectivos microorganismos que producen una amplia gama de compuestos deseables incluyendo PUFA. Sin embargo, la selección de cepas mejoradas para la producción de una molécula particular consume tiempo y es un proceso difícil.

Alternativamente, la producción de los productos químicos finos puede ser llevada a acabo de la forma más conveniente a través de producción a gran escala de plantas desarrolladas para producir los PUFA antes mencionados. Plantas particularmente bien adecuadas para este propósito son plantas de semillas oleaginosas que contienen cantidades de compuestos lipídicos de colza, canola, linaza, soja, girasol, borraja y onagra. Pero también otros cultivos de plantas que contienen aceites o lípidos y ácidos grasos son bien adecuados como se menciona en la descripción detallada de esta invención. A través de un cultivo convencional, se ha desarrollado un cierto número de plantas mutantes que producen una gama de lípidos y ácidos grasos, cofactores y enzimas deseables. Sin embargo, la selección de nuevos cultivares de plantas mejoradas para la producción de una molécula particular es un proceso que consume tiempo y complicado o aun imposible si el compuesto no se presenta de forma natural en el correspondiente cultivo de oleaginosa como en el caso de los ácidos grasos de cadena poliinsaturada C20 y superiores.

Resumen de la Invención Esta invención proporciona una novedosa molécula de ácido nucleico tal como se describe en SEQ ID NO: 1 la cual puede utilizarse para modificar aceites, ácidos grasos, lípidos, compuestos derivados de los lípidos y la más preferida para producir ácidos grasos poliinsaturados.

Los microorganismos tales como Mortierella, Entomophthora, Mucor, Cr y pthecodinium así como otras algas y hongos y plantas, especialmente plantas oleaginosas, se utilizan comúnmente en la industria para la producción a gran escala de una variedad de productos químicos finos.

Dada la disponibilidad de vectores de clonación y técnicas para la manipulación genética de los microorganismos antes mencionados y ciliados tales como los descritos en WO 98/01572 o algas y organismos relacionados tales como Phaedactylum tricornutum descrito en Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3) :239-251 así como en Dunahay

et al. 1995, Genetic transformation of diatoms, J. Phycol. 31:1004-1012 y referencias en los mismos, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden utilizarse en la ingeniería genética de estos organismos para hacerlos mejores productores o más eficientes de uno más productos químicos finos. Esta producción o eficiencia mejorada de la producción de un producto químico fino puede deberse a un efecto directo de la manipulación de un gen de la invención, o puede deberse a un efecto indirecto de tal manipulación.

Los musgos y las algas son los únicos sistemas vegetales conocidos que producen cantidades considerables de ácidos grasos poliinsaturados tales como el ácido araquidónico (ARA) y/o ácido eicosapentaenoico (EPA) y/o ácido docosahexaenoico (DHA) . Por lo tanto, las moléculas de ácidos nucleicos que se originan de un alga tal como Isochr y sis galbana son especialmente adecuados para modificar el lípido y el sistema de producción de PUFA en un huésped, especialmente en microorganismos tales como los microorganismos antes mencionados y plantas tales como las plantas oleaginosas, por ejemplo colza, canola, linaza, soja, girasol, borraja. Además los ácidos nucleicos del alga Isochr y sis galbana pueden utilizarse para identificar aquellas secuencias de ADN y enzimas en otras especies que son útiles para modificar la biosíntesis de las moléculas precursoras de los PUFA en los organismos respectivos.

El alga Isochr y sis galbana comparte un alto grado de homología en la secuencia de ADN y en los niveles de polipéptidos con otras algas permitiendo el uso de la selección heteróloga de moléculas de ADN con sondas que evolucionan de otras algas u organismos, permitiendo así la derivación de una secuencia de consenso adecuada para la selección heteróloga o la notación funcional y predicción de las funciones genéticas en terceras especies. La capacidad para identificar tales funciones puede por lo tanto tener una relevancia significativa, por ejemplo, la predicción de la específicidad de un sustrato de enzimas. Adicionalmente, estas moléculas de ácido nucleico pueden servir como secuencias de referencia para el mapeo de otras algas o para la derivación de cebadores de PCR.

Estas moléculas de ácidos nucleicos novedosas pueden codificar proteínas denominadas aquí como elongasas específicas para PUFA (PSEs o en singular PSE) . Estos PSEs son capaces de, por ejemplo, llevar a cabo una función involucrada en el metabolismo (por ejemplo la biosíntesis o degradación) de compuestos necesarios para la biosíntesis de lípidos o ácidos grasos tales como los PUFA, o colaborando en el transporte transmembrana de uno o más compuestos lipídicos / ácidos grasos bien hacia dentro a hacia fuera de la célula.

En la presente solicitud mostramos la función de una de estas secuencias en más detalles. Hemos aislado por primera vez un gen activo de funcionalidad que codifica una actividad de elongasa altamente específicada adecuada para producir ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga a partir de ácido a-linolénico (C18:3 d9, 12, 15) , mientras que el ácido y-linolénico (C18:3 d6, 9, 12) no es elongado. Por lo tanto nos referiremos aquí a un gen o proteína ASE ("elongasa específica para ácido a-linolénico") que representa así una actividad enzimática que lleva a la elongación de ácidos grasos omega-3 o ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga L-9 desaturados al menos en dos átomos de carbono. Otras publicaciones y patentes no han sido capaces antes de mostrar un gen ASE funcionalmente activo que sea específico... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico aislado que comprende un secuencia de nucleótidos derivada de una planta que codifica un polipéptido el cual elonga ácido a-linolénico (C18:39, 12, 15) en al menos dos átomos de carbono y donde el ácido y-linolénico (C18:36, 9, 12) no es elongado, seleccionado del grupo consistente de:

a) una secuencia de ácidos nucleicos representada en SEQ ID NO: 1 b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido representado en SEQ ID NO:2, c) derivados del secuencia representada en SEQ ID NO:1, la cual codifica polipéptidos que tienen al menos 50% de homología con la secuencia que codifica las secuencias de aminoácidos representadas en SEQ ID NO:2 y secuencias que funcionan como una elongasa.

2. Una secuencia de ácidos nucleicos aislada como se reivindica en la reivindicación 1, donde la secuencia se deriva de una planta.

3. Una secuencia de ácidos nucleicos aislada como se reivindica en la reivindicación 1, donde la secuencia derivada del genero Isochr y sis.

4. Una secuencia de ácidos nucleicos aislada como se reivindica en la reivindicación 1, donde el polipéptido codificado por la secuencia elonga ácido grasos L-9.

5. Una proteína codificada por un ácido nucleico aislado tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicación 1 a 3.

6. Un constructo de gen que comprende un ácido nucleico aislado que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1 como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el ácido nucleico esta funcionalmente enlazado a una o más señales reguladoras.

7. Un constructo de gen como se reivindica en la reivindicación 6, que comprende genes adicionales para la biosíntesis de ácidos grasos.

8. Un constructo de gen como se reivindica en la reivindicación 6 o 7 donde los genes adicionales para la biosíntesis de ácidos grasos se seleccionan del grupo que consiste de L19-, L17-, L15-, L12-, L9-, L8-, L6-, L5, L4-desaturasas, hidroxilasas, elongasas, L12-acetilenasa, acil-ACP-tioesterasa, 1-cetoacil-ACP-sintasa o 1cetoacil-ACP-sintasa o 1-cetoacil-ACP-reductasas.

9. Un vector que comprende un ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 1 o un constructo de gen como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.

10. Un organismo transgénico no humando que comprende al menos un ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 1, un constructo de gen como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 o un vector como se reivindica en la reivindicación 9.

11. Un organismo transgénico no humano como se reivindica en la reivindicación 10, donde el organismo es un microorganismo, un animal no humano o una planta.

12. El organismo como se reivindica en la reivindicación 10 u 11, donde el organismo es una planta transgénica.

13. Un proceso para la producción de PUFA, comprendiendo dicho proceso el cultivo de un organismo transgénico que comprende un ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 1, un constructo de gen como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 o un vector como se reivindica en la reivindicación 9 el cual codifica un polipéptido que elonga ácido a-linolénico (C18:39, 12, 15) en al menos dos átomos de carbono y donde el ácido y-linolénico (C18:36, 9, 12) no es elongado bajo condiciones en las cuales se producen PUFAs en dicho organismo.

14. El proceso como se reivindica en la reivindicación 13, donde los PUFAs producidos por el proceso son moléculas de ácidos graso C20 o C22 que tienen al menos dos dobles enlaces en la molécula de ácido graso.

15. El proceso como se reivindica en la reivindicación 13, donde las moléculas de ácido graso C21 o C22 son aisladas a partir del organismo en forma de un aceite, lípido o ácido graso libre.

16. El proceso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, donde el organismo es un microorganismo, un animal no humano o una planta.

17. El proceso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, donde el organismo es una planta transgénica.

18. El proceso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, donde el ácido graso C18 es un ácido graso que tiene 3 dobles enlaces en la molécula.

19. Un anticuerpo, el cual interactúa específicamente con un polipéptido codificado con por una secuencia de nucleótidos como se reivindica en la reivindicación 1.

20. Una secuencia de nucleótidos antisentido, la cual es complementaria a la secuencia de nucleótidos como se reivindica en la reivindicación 1.

21. Un kit que comprende una secuencia de nucleótidos como se reivindica en la reivindicación 1, un constructo de gen como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, un vector como se reivindica en la reivindicación 9 o un anticuerpo como se reivindica en la reivindicación 19.