Nuevas aciltransferasas vegetales específicas para ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga.

Método para la producción de ácidos grasos poliinsaturados en una planta de frutas oleosas caracterizado porqueel método incluye las siguientes etapas:

a) incorporación de por lo menos una secuencia de ácidos nucleicos en la planta con la secuenciarepresentada en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 20, la cual codifica para un polipéptido con una actividad deácido lisofosfatídico aciltransferasa; o

b) incorporación de por lo menos una secuencia de ácidos nucleicos en la planta, la cual se deriva de lasecuencia que codifica presente en SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 20, como resultado del código genéticodegenerado, o

c) incorporación de una secuencia de ácidos nucleicos en la planta, la cual codifica para polipéptidos conuna homología de por lo menos 80 % a nivel de aminoácidos con SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 21 y exhibeuna actividad de ácido lisofosfatídico aciltransferasa, y

d) cultivo y cosecha del organismo.

DESCRIPCIONº

Nuevas aciltransferasas vegetales especificas para acidos grasos poliinsaturados de cadena larga La presente invencion se refiere en general a un metodo para la produccion de acidos grasos poliinsaturados de cadena larga en un organismo, en el cual se incorporan acidos nucleicos en organismos que codifican para los polipeptidos con actividad de aciltransferasa. De modo ventajoso, estas secuencias de acidos nucleicos pueden expresarse dado el caso junto con otras secuencias de acidos nucleicos, que codifican para polipeptidos de la biosintesis del metabolismo de acidos grasos o lipidos, en el organismo. Ademas la presente invencion se refiere a un metodo para la produccion de aceites y/o triacilgliceridos con contenido elevado de acidos grasos poliinsaturados de cadena larga.

La invencion se refiere ademas a las secuencias de acidos nucleicos, estructuras de acido nucleico, vectores y organismos que contienen las secuencias de acidos nucleicos acordes con la invencion segun las reivindicaciones, vectores que contienen las secuencias de acidos nucleicos y/o las estructuras de acido nucleico asi como organismos transgenicos que contienen las previamente mencionadas secuencias de acidos nucleicos, estructuras de acido nucleico y/o vectores.

Otra parte de la descripcion se refiere a aceites, lipidos y/o acidos grasos producidos segun el metodo acorde con la invencion. La invencion se refiere ademas al empleo de acido lisofosfatidico-aciltransferasas acordes con la invencion, para la produccion de aceites vegetales.

En cuanto en el marco de esta descripcion se refiere a acidos nucleicos, polipeptidos y metodos y aplicaciones de tales acidos nucleicos y/o polipeptidos, tal nota sirve solamente para describir en general el ambito tecnico de la invencion, sin ampliar el objetivo de las reivindicaciones.

Los acidos grasos y triacilgliceridos tienen una multiplicidad de aplicaciones en la industria de los alimentos, la alimentacion animal, los cosmeticos y en el campo farmaceutico. Dependiendo de si son acidos grasos saturados e insaturados libres o triacilgliceridos con un elevado contenido de acidos grasos saturados o insaturados, son adecuados para diferentes aplicaciones. Los acidos grasos w-3 y acidos grasos w-6 poliinsaturados representan en ello un componente importante de la alimentacion para animales y humanos. Debido a la composicion actualmente comun de la alimentacion humana, es particularmente importante para la alimentacion una adicion de acidos grasos w-3 poliinsaturados, que estan presentes preferiblemente en aceites de pescado. De este modo por ejemplo se anaden acidos grasos poliinsaturados como acido docosahexaenoico (= DHA, C22A6M4, 7, 10, 13, 16, 19) o acido eicosapentaenoico (= EPA, C20A5M5, 8, 11, 14, 17) a los alimentos para bebes para elevar el valor nutritivo. En ello, se atribuye al acido graso insaturado DHA un efecto positivo sobre el desarrollo cerebral.

En lo que sigue, los acidos grasos poliinsaturados se denominan como PUFA, PUFAs, LCPUFA o LCPUFAs (poly unsaturated fatty acids, PUFA, acidos grasos poliinsaturados ; long chain poly unsaturated fatty acids, LCPUFA, acidos grasos poliinsaturados de cadena larga) .

Los diferentes acidos grasos y trigliceridos son obtenidos principalmente de microorganismos como Mortierella o Schizochytrium o de plantas que producen aceite como soja, colza, algas como Cr y pthecodinium o Phaeodactilum y otros, donde por regla general ellos se presentan en forma de su triacilglicerido (= triglicerido = triglicerol) . Ellos pueden ser obtenidos tambien a partir de animales como por ejemplo pescados. Los acidos grasos libres son producidos ventajosamente mediante saponificacion. Los acidos grasos poliinsaturados superiores como DHA, EPA, acido araquidonico (= ARA, C20A4M5, 8, 11, 14) , acido dihomo-y- linolenico (C20A3 M8, 11, 14) o acido docosapentaenoico (DPA, C22A5 M7, 10, 13, 16, 19) no se aislan de plantas de frutas oleaginosas como colza, soja, girasol, cartamo u otras. Las fuentes naturales comunes para estos acidos grasos son pescados como arenque, salmon, sardina, gallineta nordica, anguila, carpa, trucha, rodaballo, macarela, lucio o atun o algas.

Dependiendo de propositos de aplicacion, se prefieren aceites con acidos grasos saturados o insaturados, por consiguiente por ejemplo en la alimentacion humana se prefieren lipidos con acidos grasos insaturados especialmente acidos grasos poliinsaturados. En ello, a los acidos grasos w-3 poliinsaturados se atribuye un efecto positivo sobre el nivel de colesterol en la sangre y con ello en la posibilidad de prevencion de una enfermedad del corazon. Mediante la adicion de estos acidos grasos w-3 a la alimentacion puede reducirse claramente el riesgo de una enfermedad del corazon, un ataque de apoplejia o de presion sanguinea elevada. Tambien mediante acidos grasos w-3 se influye positivamente en los procesos inflamatorios especialmente los procesos inflamatorios cronicos en el marco de enfermedades inmunologicas como artritis reumatoide. Por eso ellos son anadidos a los alimentos, especialmente alimentos dieteticos o encuentra aplicacion en medicamentos. Los acidos grasos w-6 como acido araquidonico tienen en estas enfermedades reumaticas un efecto mas bien negativo sobre estas enfermedades, debido a la composicion comun de nuestra alimentacion.

Los acidos grasos w-3- y w-6 son precursores de hormonas histoides, los denominados eicosanoides como las prostaglandinas, que se derivan del acido acido dihomo-y-linolenico, del acido araquidonico y del acido eicosapentaenoico, los tromoxanes y leucotrienos, que se derivan del acido araquidonico y el acido eicosapentaenoico. Los eicosanoides (denominada serie PG2) , que estan formados de acidos grasos w-6 promueven por regla general reacciones de inflamacion mientras que los eicosanoides (denominada serie PG3) de acidos grasos w-3 tienen poco o ningun efecto promotor de inflamacion.

Debido a sus positivas propiedades no han faltado en el pasado aproximaciones a genes que participan en la sintesis de acidos grasos o bien trigliceridos, para poner a disposicion la produccion de aceites en diferentes organismos con contenido modificado de acidos grasos insaturados. Asi se describen en WO 91/13972 y su equivalente de Estados Unidos una M-9-desaturasa. En WO 93/11245 se reivindica una M-15-desaturasa, en WO 94/11516 se reivindica una M-12-desaturasa. Otras desaturasas son descritas por ejemplo en EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey et al., J. Biol. Chem., 265, 1990A 20144-20149, Wada et al., Nature 347, 1990A 200-203 o Huang et al., Lipids 34, 1999A 649-659. Sin embargo, la caracterizacion bioquimica de las diferentes desaturasas ha ocurrido hasta ahora solo de manera insuficiente puesto que las enzimas enlazadas como proteinas a la membrana se aislan y caracterizan solo muy dificilmente (McKeon et al., Methods in Enzymol. 71, 1981A 12141-12147, Wang et al., Plant Physiol. Biochem., 26, 1988A 777-792) . Por regla general, la caracterizacion de desaturasas unidas a la membrana ocurre mediante incorporacion en un organismo adecuado, al cual se le investiga a continuacion la actividad enzimatica por medio de analisis de eductos y productos. Las M-6-desaturasas son descritas en WO 93/06712, US 5, 614, 393, US 5, 614, 393, WO 96/21022, WO 00/21557 y WO 99/27111 y tambien se describe la aplicacion para la produccion en organismos transgenicos como en WO 98/46763, WO 98/46764, WO 9846765. En ello se describe y reivindica tambien la expresion de diferentes desaturasas como en WO 99/64616 o WO 98/46776 y la formacion de acidos grasos poliinsaturados. Respecto a la efectividad de la expresion de las desaturasas y su influencia en la formacion de acidos grasos poliinsaturados, es de resaltar que mediante expresion de una desaturasa individual como se ha descrito hasta ahora, se alcanzaron solo pequenos contenidos de acidos grasos insaturados/lipidos como por ejemplo acido y-linolenico y acido estearidonico. Ademas se obtuvo por regla general una mezcla de acidos grasos w-3- y w-6.

Son microorganismos particularmente adecuados para la produccion de PUFAs los microorganismos como microalgas como Phaeodactilum tricornutum, tipos de Porphoridium, tipos de Thraustochytrien, tipos de Schizochytrien o tipos de Cr y pthecodinium, ciliados, como Stylonychia o Colpidium, hongos como Mortierella, Entomophthora o Mucor y/o musgos como Physcomitrella, Ceratodon y Marchantia (R. Vazhappilly & F. Chen (1998) Botanica Marina 41A 553-558; K. Totani & K. Oba (1987) Lipids 22A 1060-1062; M. Akimoto et al. (1998) Appl. Biochemistr y and Biotechnology 73A 269-278) . Mediante seleccion de las cepas se habia desarrollado un numero de cepas mutantes de los correspondientes microorganismos, que producian una serie de compuestos valiosos, incluyendo PUFAs.... [Seguir leyendo]

1. Metodo para la produccion de acidos grasos poliinsaturados en una planta de frutas oleosas caracterizado porque el metodo incluye las siguientes etapasA

a) incorporacion de por lo menos una secuencia de acidos nucleicos en la planta con la secuencia representada en SEQ ID NOA 1 o SEQ ID NOA 20, la cual codifica para un polipeptido con una actividad de acido lisofosfatidico aciltransferasa; o b) incorporacion de por lo menos una secuencia de acidos nucleicos en la planta, la cual se deriva de la secuencia que codifica presente en SEQ ID NOA 4 o SEQ ID NOA 20, como resultado del codigo genetico degenerado, o c) incorporacion de una secuencia de acidos nucleicos en la planta, la cual codifica para polipeptidos con una homologia de por lo menos 80 % a nivel de aminoacidos con SEQ ID NOA 2 o SEQ ID NOA 21 y exhibe una actividad de acido lisofosfatidico aciltransferasa, y

d) cultivo y cosecha del organismo.

2. Metodo para la produccion de acidos grasos poliinsaturados segun la reivindicacion 1, caracoerizaoo porºue adicionalmente a las secuencias de acidos nucleicos mencionadas bajo (a) a (d) se incorporaron en el organismo otras secuencias de acidos nucleicos, que codifican para polipeptidos del metabolismo de acidos grasos o lipidos elegidos de entre el grupo de acil-CoA-deshidrogenasa (s) , acil-ACP[= acil carrier protein]-desaturasa (s) , acil-ACPtioesterasa (s) , acil-transferasa (s) de acidos grasos, acil-CoAAlisofosfolipido-aciltransferasa (ssintetasa (s) de acidos grasos, hidroxilasa (s) de acidos grasos, acetil-Coenzima carboxilasa (s) A, acil-Coenzima oxidasa (s) A, desaturasa (s) de acidos grasos, acetilenasa (s) de acidos grasos, lipoxigenasa (s) , triacilglicerol-lipasa (s) , oxidos de alenosintetasa (s) , hidroperoxido-liasa (s) o elongasa (s) de acidos grasos.

3. Metodo para la produccion de acidos grasos poliinsaturados segun las reivindicaciones 1 o 2, caracoerizaoo porºue adicionalmente a las secuencias de acidos nucleicos mencionadas bajo (a) a (d) se incorporaron en el organismo otras secuencias de acidos nucleicos, que codifican para polipeptidos elegidas de entre el grupo de acilCoAAlisofosfolipido-aciltransferasa, delta-4-desaturasa, delta-5-desaturasa, delta-6-desaturasa, delta-8-desatuase, delta-9-desaturasa, delta-12-desaturasa, delta-5-elongasa, delta-6-elongasa o delta-9-elongasa.

4. Metodo para la produccion de acidos grasos poliinsaturados segun una de las reivindicaciones 1 a 3, caracoerizaoo porºue los acidos grasos poliinsaturados producidos son acidos grasos C18, C20, C22 o C24.

5. Metodo para la produccion de acidos grasos poliinsaturados segun una de las reivindicaciones 1 a 4, caracoerizaoo porºue los acidos grasos poliinsaturados son aislados del organismo en forma de un aceite, lipido o un acido graso libre.

6. Metodo para la produccion de acidos grasos poliinsaturados segun una de las reivindicaciones 1 a 5, caracoerizaoo porºue los acidos grasos poliinsaturados producidos en el metodo son acidos grasos C18, C20, C22 o C24 con por lo menos dos dobles enlaces en la molecula.

7. Metodo para la produccion de acidos grasos poliinsaturados segun una de las reivindicaciones 1 a 6, caracoerizaoo porºue en el metodo se produce un acido graso poliinsaturado elegido de entre el grupo de acido eicosapentaenoico, acido docosapentaenoico y acido docosahexaenoico.

8. Secuencia de acidos nucleicos elegidas de entre el grupoA

a) una secuencia de acidos nucleicos con la secuencia representada en SEQ ID NOA 1 o SEQ ID NOA 20,

b) secuencias de acidos nucleicos, que como resultado del codigo genetico degenerado, se derivan de la secuencia que codifica presente en SEQ ID NOA1 o SEQ ID NOA 20,

c) secuencias de acidos nucleicos, que codifican para polipeptidos con una identidad de por lo menos 80 % a nivel de aminoacidos con SEQ ID NOA 2 o SEQ ID NOA 21 y exhiben una actividad de acido lisofosfatidico aciltransferasa.

9. Secuencia de aminoacidos que esta codificada por una secuencia de acidos nucleicos segun la reivindicacion 8 y posee actividad de acido lisofosfatidico aciltransferasa.

10. Estructura de gen que contiene un acido nucleico segun la reivindicacion 8, donde el acido nucleico esta unido funcionalmente a una o varias senales de regulacion.

11. Estructura de gen segun la reivindicacion 10, caracoerizaoa porºue la estructura de gen contiene genes de biosintesis adicionales del metabolismo de acidos grasos o lipidos, elegidos de entre el grupo de acil-CoA

deshidrogenasa (s) , acil-ACP [= acilºcarrier protein]-desaturasa (s) , acil-ACP-tioesterasa (s) , acil-transferasa (s) de acidos grasos, acil-CoAAlisofosfolipido-aciltransferasa (s) , sintetasa (s) de acidos grasos, hidroxilasa (s) de acidos grasos, acetil-Coenzima carboxilasa (s) A, acil-Coenzima oxidasa (s) A, desaturasa (s) de acidos grasos, acetilenasa (s) de acidos grasos, lipoxigenasa (s) , triacilglicerol-lipasa (s) , oxidos de aleno sintetasa (s) , hidroperoxido liasa (s) o elongasa (s) de acidos grasos.

12. Estructura del gen segun las reivindicaciones 10 u 11, caracoerizaoa porºue la estructura de gen contiene genes de biosintesis adicionales del metabolismo de acidos grasos o lipidos elegidos de entre el grupo de acilCoAAlisofosfolipido-aciltransferasa, delta-4-desaturasa, delta-5-desaturasa, delta-6-desaturasa, delta-8-desaturasa, delta-9-desaturasa, delta-12-desaturasa, delta-5-elongasa, delta-6-elongasa o delta-9-elongasa.

13. Vector que contiene un acido nucleico segun la reivindicacion 8 o una estructura de gen segun una de las 15 reivindicaciones 10 a 12.

14. Plantas de frutas oleosas que contienen por lo menos un acido nucleico segun la reivindicacion 8, una estructura de gen segun una de las reivindicaciones 10 a 12 o un vector segun la reivindicacion 13.

15. Empleo de una acido lisofosfatidico aciltransferasa segun la reivindicacion 9 para la produccion de un aceite vegetal en una planta de frutas oleosas.

Figura 1A Categoria de vector de pSUN3CeLPLAT

Figura 2A Comparacion de secuencias de aminoacidos de C. elegans LPLATs (Ce-T06E8.1 y Ce-F59F4.4) con la LPAAT de M. musculus (Mm-NP061350) .

Figura 3A Perfil de acidos grasos de celulas transgenicas de S. cerevisiae C13ABYS86 Figura 4A Elongacion exogena aplicada a 18A2L9, 12 o bien 18A3L9, 12, 15 despues de su desaturacion L-6 endogena

(datos de Fig. 2 y 3) . Figura 5A Perfil de acidos grasos de celulas transgenicas de S. cerevisiae C13ABYS86

Figura 6A Composicion de acil-CoA de levaduras INVSc1 transgenicas, que habian sido transformadas con los vectores pESCLeu PpD6Pse1/pYes2 (A) o pESCLeu-PpD6-Pse1/pYes2- T08E8.1 (B) .

Figura 7A Perfil de acidos grasos de celulas transgenicas de S. cerevisiae INVSc1 Figura 8A Perfil de acidos grasos de celulas transgenicas de S. cerevisiae INVSc1 Figura 9AA Categoria de vector de pGPTV LeB4-700 + T06E8.1 Figura 9BA Categoria de vector de pGPTV USP/OCS-1, 2, 3 PSE1 (Pp) +D6-Des (Pt) +2AT (T06E8-1) Figura 10AA Ruta de biosintesis de LCPUFAs Figura 10BA Ruta de biosintesis de LCPUFAs Figura 11A Comparacion de especificidades de sustrato de GPAT y LPAAT en lino, girasol, y Mortierella alpina Figura 12A Comparacion de especificidades de sustrato de LPCAT en lino, girasol y Mortierella alpina Figura 13A Comparacion de SEQ ID NOA 2 con banco de datos Swiss-Prot Figura 14A Comparacion de SEQ ID NOA 5 con bancos de datos de Swiss-Prot Figura 15A Comparacion de SEQ ID NOA 35 con bancos de datos de Swiss-Prot

Figura 16A Comparacion de SEQ ID NOA 23 con banco de datos Swiss-Prot

Figura 17A Comparacion de SEQ ID NOA 27 con banco de datos Swiss-Prot

Figura 18A Comparacion de SEQ ID NOA 8 con banco de datos Swiss-Prot

Figura 19A Comparacion de SEQ ID NOA 10 con banco de datos Swiss-Prot

Figura 20A Comparacion de SEQ ID NOA 12 con banco de datos Swiss-Prot

Figura 21A AA Analisis Western Blot de la LPAAT de Thraustochytrium expresada en E. Coli como proteina de fusion (LPAAT-FP) con tag GST terminal en N y tag His terminal en C.

B. Especificidad de Acil-CoA de la LPAAT de Thraustochytrium expresada como proteina de fusion en E. Coli Figura 22A AA Analisis Western Blot de la LPAAT de Shewanella expresada en E. Coli como proteina de fusion con tag His terminal en C

BA Expresion funcional de la LPAAT de Shewanella en E. coli Figura 23A Expresion de LPAAT de Mortierella /MaB4 AT) en levaduras y forraje de acidos grasos 18A2L9, 12 (A+B) Figura 24A Expresion de LPAAT de Mortierella /MaB4 AT) en levaduras y forraje de acidos grasos 18A3L9, 12, 15 (C+D)

Figura 25A Expresion de LPAAT de Mortierella /MaB4 AT) en levaduras y forraje de acidos grasos 18A2L9, 12 (A+B) . Analisis de los lipidos neutros Figura 26A Expresion de LPAAT de Mortierella /MaB4 AT) en levaduras y forraje de acidos grasos 18A3L9, 12, 15 (C+D) . Analisis de los lipidos neutros.